求助：shRNA的问题

liumenghan

刚开始做shRNA，已经设计出来几个序列。但是总怕这个shRNA 会对其他的基因造成一定的沉默作用，产生不可控的影响。
7 W; R7 R0 [: J. c* N! Z各位有没有什么好的排除方法？或者可以打消我这个疑虑？
! E# N, F* U$ X0 X8 a先谢过了

老十

这个，只有看人家用过的或是公司的才最保险，自己做那就要筛选，最后自己确定。

liumenghan

# J( g( l3 @0 P' c$ T3 `+ a) x

7 p1 E; g! p. o5 o) y, _) w7 d回复 老十 的帖子6 a( m5 J( i0 ^3 ~
# D$ u) Z1 `: u, \* S, S( G" O9 f: o
筛选和证明有效都要做的。& J( x2 N' e) ~
可是我觉得公司的也不一定保险，我从sigma网站上看到了一些validate的shRNA 序列。放到NCBI上blast了一下。有mRNA跟设计的shRNA序列重复率，高的有达到 百分之百，而百分之七八十也很是常见。虽然跟目的mRNA 功能上有一定距离，总觉得不放心。
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老十

如果是sigma网站上的就要多试试了，自己筛选。别人文献里找到的序列也要自己验证。实在不行就要买公司的shRNA,当然也要验证。

老十

不好意思，我真的也没帮上你什么，我做shRNA 也很迷惑，即使我的目的基因下调了，会不会他同时脱靶hit到别的基因，后来只能自己通过其他方法验证了。看表型决定

BNJN

多做几个不同位置的shRNA就好了，如针对3‘、5’非编码区和CDS的；还要加control，如针对GFP、Luciferase的shRNA

liumenghan

3 I) m4 U( D* o4 k& t
" H+ _7 {: s  h. a/ [0 r回复 老十 的帖子9 u: w- B& m2 T, N! G) x6 X* m, f
4 t. r9 z- b1 v. A! r5 f0 U1 k
没关系的，大家一起讨论进步。我也再边做边思考一下
5 T! w0 l! o4 V2 Y- i9 k6 v. a我最后还是挑了和别的基因重合率最低的几对shRNA。& b9 ~/ |4 A% }' u7 V, `" J1 O
我看了下书。现在感觉hit到其他的情况应该是不可避免的。只是knock down与他重合率60-70%的基因效率应该很低，低到可以忽略。毕竟沉默的RNA与其序列重合率是百分之百。
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liumenghan

回复 BNJN 的帖子
/ E+ z! k8 Q: d/ O' V" q, m6 @& ~) D  y8 ^. |
多做几个不同位置，只能保证一定会knock down。。好像也不能解决干扰其他基因的作用吧？0 }3 P/ l1 U/ W
另外GFP和luciferase是载体上的吧？这个做control有什么作用呢。。。
/ e, z, b$ E( n8 K4 w, j$ Y没想通啊，求解答。

老十

5 X7 y6 _3 d# _- u5 E

4 U6 B5 Q" j) @. r5 w8 U% p3 r( bGFP和luciferase作为control就是认为带一段无意义的片段，然后转入细胞，表明我们这个Knockdown 是shRNA上的target片段起作用，而不是ShRNA 插入载体的作用，或是说不是单纯的转入shRNA载体的作用。也使得筛选过程中的control更严格。( U' ^/ P/ U3 d' l# E
没帮到你什么，自己多看paper吧。加油了，

BNJN

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, ?% E! u2 ], [, p0 V' y- o6 F' E+ A6 l  O6 w- d) O  C  D& }" {5 v
几个不同位置，并且blast之后没有与其他基因相重叠，就初步说明没有影响其他基因。如果敲掉后表型、其他基因表达变化情况相同，就可以说明变化是由目的基因的knock down引起的。如果一定要考究shRNA有没有干扰其他基因，很难，而且很有可能是KD后引起的变化。