电转试剂盒LONZA以及电转细胞与质粒比

hjd8886

求问LONZA电转试剂盒全名，用于电转角质细胞的用哪一个？电转仪参数？3 B. Y0 G* X1 N
另外电转的时候细胞和质粒的比例大概多少合适？看之前论坛里发的“细胞和质粒的比例我用过30ug-80ug：106-107”这个是100万的细胞用30ug的质粒吗？

genedu

回复 hjd8886 的帖子& T$ R# ~$ o- S1 r# T! _9 M

7 z6 z) z* t  i6 d0 Z- ~5 _前几个问题，您去他的网站上查查，都有。
& r2 r; _+ _( {' `! a/ X4 k“100万的细胞用30ug的质粒”个人感觉太多了，细胞受不了，会死很多。按照我的经验，100万细胞用3-4微克质粒即可，当然质粒的浓度最好在1ug/ml左右，仅仅是个人经验，仅供参考

genedu

回复 hjd8886 的帖子' x" {. u9 `; f3 m/ k
3 w/ N4 O1 r: Q' Z
再啰嗦一句，如果是要电转细胞，并且电转的细胞还要进行后期操作的话，最好是用区内毒素的试剂盒进行大提质粒

hjd8886

回复 genedu 的帖子
! e$ b# W& l& B6 |( s7 F+ J$ M& u* f4 R4 G: G* m
灰常感谢啊，不过昨天已经电转了，呵呵。
, ~" T" e# N' z* e9 _8 Y我的是一个10cm盘的角质细胞，然后分了4次电转，一次大约150万的细胞对应6ug的质粒，第一次电转的时候，电转仪报错，转盘很快的就转回来了，不知道有没有电转成功，怕再次电转细胞会死很多，就没有处理，然后就直接转移到10cm盘培养，但是没有及时摇匀，好多细胞都贴壁了，汗。。。。

genedu

回复 hjd8886 的帖子
( E; k/ l$ R% ~0 L; X' k
7 i' X$ M' B. R7 H我用Lonza大概电转了将近1000次了，针对您的问题给你点儿小建议：1  100万的细胞用4ug质粒，点击液100ul的体系最佳，点击液注意4℃保存。2  电转仪报错，转盘很快的就转回来，就是电转没有成功，必须重新电击，不然的话是不起作用的。这里面有几个原因：一个是细胞量太大造成的；一个是质粒量太大造成的；一个是电转程序不对造成的，一个是电击杯中有气泡造成的。3   针对您“直接转移到10cm盘培养，但是没有及时摇匀，好多细胞都贴壁了”的问题，在电转完成后，应该先将电击的细胞马上转入培养基中（培养基根据所要铺板的多少，应提前准备在15或者是50ml离心管中），再用移液器混匀，铺板，问题就解决了

hjd8886

回复 genedu 的帖子
$ x5 Q2 h/ y( G, B5 s
' h5 {% ?% K: K1 @非常感谢啊，今天看了下细胞，第一组报错的确实是没有电转成功，好多细胞都贴壁的，而另一组电转成功的细胞死亡非常多，贴壁的倒是很少，两组之间细胞密度差距非常大。

genedu

回复 刘明东 的帖子
+ ?, c5 \9 J! J. ~3 d) j2 l* i' G1 c. \* U6 y
不好意思刘同学，我的QQ是经常不上的，有什么问题您直接在这里讲就中，本人保证知无不言言无不尽，相互交流共同提高

sirius_zou

回复 genedu 的帖子8 ?* p/ b  I+ g. O" A6 v) \
/ f, v0 W0 z! h$ W6 w* X
您好，我也正在做核转染诱导ips实验, p1 R  O4 {+ C8 g* P- Z
请问您做过悬浮细胞的电转吗？电转后细胞死亡多吗？我电转100万个CD34细胞用10ug质粒，2天后细胞死亡一半以上，正常吗？

genedu

回复 sirius_zou 的帖子" _6 g, T% N2 R. ]9 O% L  `

) S! V$ M( O, S$ d$ X电转悬浮的细胞和贴壁的成纤维细胞之间并无太大差别，不过每种细胞因为他们的直径大小，细胞膜厚度以及承受电容的不同，需要进行一定的程序摸索（LONZA网站上提供的只是参考电转参数），一般的来说，电转后死亡10-30%，属于正常死亡。电转100万个细胞用100ul的电击液和4ug的质粒就足够了，多了反而会造成细胞的死亡，质粒最好是大提的（去内毒素）。我之前电转过鸡的悬浮淋巴细胞，电转参数为B013，效率还是蛮高的，仅供参考。如果是第二天加药物筛选的话，2天后死亡一半还是比较正常的，当然这也和你的电转质粒的整合率和表达情况是相关的。所以，假如您应该先摸电转程序和适合的电击液，后电转pMAX-GFP（自带）质粒，统计电转效率，再做定夺。

Jonathan

回复 sirius_zou 的帖子# p- g  {: g) A
) S$ i+ ?; y. N2 [' Z6 E
我用了6ug。1m的CD34+cell。完全没问题。细胞会死一些。ips出的杠杠的