求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。

2013sp

求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。

490096812

我们做过猪，相对比小鼠的要难一些

biovictor

我只做过一次，猪的不好养呀！后来就放弃了。不仅形态上很难鉴定（就算筛选完之后），貌似都很难遇到典型的串珠样克隆；另外比较麻烦的是，总是支原体污染，比较恶心。

小咪咪

简单的就是：剪碎-消化-过筛-培养。这样就行了~

2013sp

回复 小咪咪 的帖子$ r" q1 o! l" D# D% I8 G7 C
8 t5 M# U# e% N) e( n+ o1 m# |
能提供详细的注意事项吗？/ p& O/ v4 |8 z+ l: i; N

490096812

给你个流程吧：/ A$ ^, \* T; y7 c4 o7 `
1. 猪场采集的睾丸样品置于含3倍双抗pbs的离心管中（离心管与冰袋一起放置于盒子中），带回实验室，置于4度冰箱。
' j2 H% }  R. @2 }- E: r2. 需要灭菌的东西：手术器械（5把小剪刀、2把大镊子、8把小镊子、2把手术刀柄、100目和200目的滤网各一个）、纱布、PBS、超纯水、离心管（1.5、15、50ml）、血清瓶、枪头、蓝盖瓶、小烧杯、玻璃皿、毛巾。
& y% F# M$ I- F6 F6 y* S& G0 _4 }8 u3 A3. 提前配制DMEM、双抗、PBS、胶原酶（2mg/ml）、胰酶（7mg/ml）。
# W5 v. D( F3 I* }" p4. 取出采集的新鲜睾丸样品，在含3倍双抗PBS的50ml离心管中洗3次，转移到含75%酒精的50ml离心管中浸泡并不时摇晃5min，然后转移到含3倍双抗PBS的小烧杯中清洗后再转移至含PBS的另一小烧杯，如此再 重复1次（总共过3个小烧杯）。) [4 d( }: w6 Q( X
5. 将睾丸样品从最后一个小烧杯中转移至玻璃皿中，剪去外侧的浆膜，注意不要将白膜剪破。
& _3 g2 L! m) q$ a# }1 T1 M6. 将睾丸样品在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗3次（依次过3个玻璃皿）后转移到一个新皿中，加入少量PBS，用镊子夹起手术刀片装在刀柄上并在酒精灯上灭菌，用PBS降温后剥离组织。9 y4 Q  _$ i- K/ s+ }! @
7. 剥离后的组织在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗1次，转移至一个新皿，用剪刀剪取组织，不要剪到白色的结缔组织。用镊子将小块转移至含有胶原酶的50ml离心管中，封口胶封好，震荡数次后放入37度水浴锅消化。3 p- L( }7 I* n3 ~# f' M
8. 胶原酶消化，根据消化情况可先将已消化出的小管分出，剩余组织块继续消化。
+ H0 M3 q- a% |2 `) P9. PBS洗4次除去血细胞，第3次洗时加入Dnase。: X! k) E* o2 R7 q+ L
10. 胰酶消化并加入Dnase，严格控制消化时间，保证活率。& S: @% k" W, ^
11. 血清终止消化，细胞悬液依次过100目和200目滤网。
; R: w5 y: H! K% k- [8 k12. 离心，DMEM重悬，根据细胞数目接种至大皿，进行差异贴壁。
; E/ i4 [. ^, ]5 \4 Z! ]+ b( N8 y13. 差异贴壁（15min-20min-25min-30min-35min-40min），接种的细胞数量和活力不同贴壁时间可有差异，若细胞贴壁情况不佳可延长贴壁时间，贴壁性原细胞过多可适度吹打。& b- t7 R' v4 f
14. 收集差异贴壁后的悬液，离心，PBS洗3次减少细菌数量，接种至含5%血清、2~3倍双抗的培养基中过夜。
7 a' ]/ a) N  n15. 第二天收集吹打和稀释10倍胰酶消化后的悬液，可得到高纯度的性原细胞，若支持细胞数量偏少，可在分出性原细胞后，用胰酶原液消化出少量贴壁的支持细胞。若仍可观察到细菌，再用PBS洗3次。8 {8 b% t, I1 y$ Z4 m) U0 l3 a2 E" C

小咪咪

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% S. y& i9 C" q/ w! ~2 a; Z. w5 X! G
详细步骤你可以参考楼下的，我觉得他写得挺详细的。& \, h) r+ U7 I% k9 e$ a; n
注意事项：1.保证整个操作过程中不要污染。4 q0 z" U  Z- X7 _
                  2.所取睾丸不能太大，3-5条较好，保证能够取到细胞。
9 ]& A  r- o# ?' |" {                  3.Dnase消化时间不能太长，否则取得的细胞也会很少。: ~  G+ A5 c  J3 A9 r$ W

w343989328

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$ ^9 B+ G9 |3 w( U6 w. e, e& b( X* h: |( T2 z
你们取的是多少天的猪的睾丸

490096812

回复 w343989328 的帖子3 V5 [5 t# i  c7 _
* c* a9 V8 X1 S7 x0 w+ r  l
越小的越好吧

w343989328

回复 490096812 的帖子- R9 z  l/ Z8 j: s4 y4 `: J
& c1 }7 I/ F) N; n( `# O" n4 P/ }1 }
刚生出来的小猪，算是gonocytes不是spermatogonial stem cell吧