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给你个流程吧：
1 Y6 O# @7 E5 Y3 A1. 猪场采集的睾丸样品置于含3倍双抗pbs的离心管中（离心管与冰袋一起放置于盒子中），带回实验室，置于4度冰箱。
5 H' K0 t- t! Z) Q5 {2. 需要灭菌的东西：手术器械（5把小剪刀、2把大镊子、8把小镊子、2把手术刀柄、100目和200目的滤网各一个）、纱布、PBS、超纯水、离心管（1.5、15、50ml）、血清瓶、枪头、蓝盖瓶、小烧杯、玻璃皿、毛巾。
0 k; n1 A7 }7 E3. 提前配制DMEM、双抗、PBS、胶原酶（2mg/ml）、胰酶（7mg/ml）。& }/ [: A$ S& X! k" K2 L f5 v
4. 取出采集的新鲜睾丸样品，在含3倍双抗PBS的50ml离心管中洗3次，转移到含75%酒精的50ml离心管中浸泡并不时摇晃5min，然后转移到含3倍双抗PBS的小烧杯中清洗后再转移至含PBS的另一小烧杯，如此再 重复1次（总共过3个小烧杯）。
% k6 a9 {: o7 U! A$ ]% E; q% {) [5. 将睾丸样品从最后一个小烧杯中转移至玻璃皿中，剪去外侧的浆膜，注意不要将白膜剪破。& `8 [7 k$ Z b* ?/ X5 g, }3 h/ C
6. 将睾丸样品在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗3次（依次过3个玻璃皿）后转移到一个新皿中，加入少量PBS，用镊子夹起手术刀片装在刀柄上并在酒精灯上灭菌，用PBS降温后剥离组织。( w5 h% b9 w" ^5 Y
7. 剥离后的组织在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗1次，转移至一个新皿，用剪刀剪取组织，不要剪到白色的结缔组织。用镊子将小块转移至含有胶原酶的50ml离心管中，封口胶封好，震荡数次后放入37度水浴锅消化。
: B! @5 K$ ?& T) P/ q1 F; O9 H8. 胶原酶消化，根据消化情况可先将已消化出的小管分出，剩余组织块继续消化。
- L$ ^0 r1 J3 n1 H9. PBS洗4次除去血细胞，第3次洗时加入Dnase。
4 m) G! J. O2 \' W10. 胰酶消化并加入Dnase，严格控制消化时间，保证活率。
0 u) h0 ^# N* H9 R' L. \11. 血清终止消化，细胞悬液依次过100目和200目滤网。1 x! k, i2 Q2 W0 U& P
12. 离心，DMEM重悬，根据细胞数目接种至大皿，进行差异贴壁。
7 b2 n# Y" F6 m2 T: v13. 差异贴壁（15min-20min-25min-30min-35min-40min），接种的细胞数量和活力不同贴壁时间可有差异，若细胞贴壁情况不佳可延长贴壁时间，贴壁性原细胞过多可适度吹打。, u# _3 o* }# P' W, T& r! \
14. 收集差异贴壁后的悬液，离心，PBS洗3次减少细菌数量，接种至含5%血清、2~3倍双抗的培养基中过夜。6 M/ z; I' E& r' G- m# k5 ^
15. 第二天收集吹打和稀释10倍胰酶消化后的悬液，可得到高纯度的性原细胞，若支持细胞数量偏少，可在分出性原细胞后，用胰酶原液消化出少量贴壁的支持细胞。若仍可观察到细菌，再用PBS洗3次。
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发表于 2013-10-11 10:24
。不仅形态上很难鉴定（就算筛选完之后），貌似都很难遇到典型的串珠样克隆；另外比较麻烦的是，总是支原体污染，比较恶心。
