求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。

2013sp

求猪SSC培养的操作步骤以及注意事项，不胜感激。

490096812

回复 w343989328 的帖子
. Q$ U/ |* [7 q6 p8 R8 Z- {; N* k$ Y; K7 m4 F3 r$ [- V( N/ d
的确是，这也是研究的一个瓶颈。但是采大猪的样不好采啊，人家都在7d以内就阉割了

w343989328

回复 490096812 的帖子# P4 F' r8 t- e& Z; L; b
8 N+ a) U3 M. V% ]) E9 v
刚生出来的小猪，算是gonocytes不是spermatogonial stem cell吧

490096812

回复 w343989328 的帖子, y" J$ s" A( a8 B/ T1 _0 L
. X9 e7 I. z* V6 Q2 i) V
越小的越好吧

w343989328

回复 490096812 的帖子
  w, n+ T$ F" Q, Z% e( T+ _8 d
  p6 n) `: F& W* M' T你们取的是多少天的猪的睾丸

小咪咪

回复 2013sp 的帖子
6 ?- ^3 E5 v1 }8 B: J) v! s6 |" W
. ]' n. _- R1 x8 L' p5 C5 g详细步骤你可以参考楼下的，我觉得他写得挺详细的。, M# n; C" N% E, I, s
注意事项：1.保证整个操作过程中不要污染。/ z7 Y' o+ f  ~2 `& ?# c" b
                  2.所取睾丸不能太大，3-5条较好，保证能够取到细胞。
4 h% b# [, ?( T3 d' x                  3.Dnase消化时间不能太长，否则取得的细胞也会很少。+ K# M2 K& d  B; a5 z1 S+ D

490096812

给你个流程吧：
! W/ c; V6 V+ [- q1. 猪场采集的睾丸样品置于含3倍双抗pbs的离心管中（离心管与冰袋一起放置于盒子中），带回实验室，置于4度冰箱。: }) G, s  B  A4 Z( z1 c# }
2. 需要灭菌的东西：手术器械（5把小剪刀、2把大镊子、8把小镊子、2把手术刀柄、100目和200目的滤网各一个）、纱布、PBS、超纯水、离心管（1.5、15、50ml）、血清瓶、枪头、蓝盖瓶、小烧杯、玻璃皿、毛巾。3 l; \3 W/ S4 t3 }' q- u
3. 提前配制DMEM、双抗、PBS、胶原酶（2mg/ml）、胰酶（7mg/ml）。! K8 B- X% }# T- C' L5 U- k
4. 取出采集的新鲜睾丸样品，在含3倍双抗PBS的50ml离心管中洗3次，转移到含75%酒精的50ml离心管中浸泡并不时摇晃5min，然后转移到含3倍双抗PBS的小烧杯中清洗后再转移至含PBS的另一小烧杯，如此再 重复1次（总共过3个小烧杯）。
2 {2 y3 |& z& [( C5. 将睾丸样品从最后一个小烧杯中转移至玻璃皿中，剪去外侧的浆膜，注意不要将白膜剪破。
8 {% r- P- C6 |, H6. 将睾丸样品在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗3次（依次过3个玻璃皿）后转移到一个新皿中，加入少量PBS，用镊子夹起手术刀片装在刀柄上并在酒精灯上灭菌，用PBS降温后剥离组织。
% d9 q, U- O9 Y& ]4 l7. 剥离后的组织在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗1次，转移至一个新皿，用剪刀剪取组织，不要剪到白色的结缔组织。用镊子将小块转移至含有胶原酶的50ml离心管中，封口胶封好，震荡数次后放入37度水浴锅消化。
/ q) W# v4 k' r8. 胶原酶消化，根据消化情况可先将已消化出的小管分出，剩余组织块继续消化。) q0 N. ^2 s, `  ?; t1 j7 v
9. PBS洗4次除去血细胞，第3次洗时加入Dnase。
1 l: m: [2 e. h2 L: a3 |8 Q10. 胰酶消化并加入Dnase，严格控制消化时间，保证活率。: Z4 \2 `3 V0 T9 j) K9 B
11. 血清终止消化，细胞悬液依次过100目和200目滤网。& d. l2 J8 B+ x0 [( {& q& Q7 I
12. 离心，DMEM重悬，根据细胞数目接种至大皿，进行差异贴壁。
1 K3 n/ b: G8 F- ~6 c13. 差异贴壁（15min-20min-25min-30min-35min-40min），接种的细胞数量和活力不同贴壁时间可有差异，若细胞贴壁情况不佳可延长贴壁时间，贴壁性原细胞过多可适度吹打。: D! @. M$ u* O# ^, F
14. 收集差异贴壁后的悬液，离心，PBS洗3次减少细菌数量，接种至含5%血清、2~3倍双抗的培养基中过夜。
" E  M8 x, I8 r$ t0 |, W15. 第二天收集吹打和稀释10倍胰酶消化后的悬液，可得到高纯度的性原细胞，若支持细胞数量偏少，可在分出性原细胞后，用胰酶原液消化出少量贴壁的支持细胞。若仍可观察到细菌，再用PBS洗3次。  {# E$ t, W" {% W- U, Z

2013sp

回复 小咪咪 的帖子$ }& x- V4 v! P0 v
* ^# B+ G) s$ J7 H+ Y6 @! j: v, A, g% i
能提供详细的注意事项吗？5 Z& `5 V9 e5 O2 |/ K

小咪咪

简单的就是：剪碎-消化-过筛-培养。这样就行了~

biovictor

我只做过一次，猪的不好养呀！后来就放弃了。不仅形态上很难鉴定（就算筛选完之后），貌似都很难遇到典型的串珠样克隆；另外比较麻烦的是，总是支原体污染，比较恶心。