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自己一直在做蛋白诱导猪iPSCs的工作，最近看了一篇相关方面的文献，在这里与大家分享下！同时也有以下疑问想下大家请教下，欢迎拍砖！！！
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9 a2 _! f& P2 Y7 _ l题目：Partial Somatic to Stem Cell Transformations Induced By Cell-Permeable Reprogramming Factors 杂志：Nature 下面的SCIENTFI REPORTS , IF 不高，但文章质量还不错，如十几年前 cell 下面的 stem cell， 文章作者为KIM，参考文献中有他的三篇一作SCI论文，推测可能是做蛋白生产、生物治疗和疾病机制等方面工作；这篇文章应该是其第一篇蛋白诱导重编程的文章。 文章的工作量还是不小的，且只有四个作者，还要除去一个通讯作者，文章详见附件！！！ ) k& G) v, t; t
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一. 文章的结构：
! q r) D; N# J% N1. 蛋白的制备分为A、B两组：
0 ]1 Y" h( p# D% g8 \% F( i# aA组: Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc和Nanog（OSKMN） 的编码区亚克隆至Pet28a载体中，同时加上MTD（使重组蛋白入核）, HIS-TAG（利于纯化）, NLS（核定位序列）等序列，获得重组蛋白； 可能由于A组没有针对表达菌株为大肠杆菌进行密码子优化，OSKMN的表达量不高，且是包涵体表达；在此基础上，想获得 更多 和可溶性的 重组蛋白，于是有了B组。
, l V @# V5 \6 e: {' Y1 o" [1 m; DB组: ，对OSKML进行了基因优化，同时根据蛋白的表达量和可溶性表达 筛选了不同的MTD, 但遗憾地是，好像文章后续诱导所用的蛋白为变性条件下的蛋白。
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2. A组重组蛋白介导的重编程（hES培养体系）：有两种方法：A组：诱导全过程中添加蛋白；B组：间断添加蛋白
: A i4 g0 i6 R考虑A组蛋白在与细胞共培养时有析出现象，且Nanog溶解度最低，于是考虑使用B组蛋白介导重编程。) C. O3 _9 w+ r8 x1 C7 Y9 Y
1 G; l+ r& P- B" Q D, w3. B组重组蛋白介导的重编程（偏重于mES培养体系）：也有两中种方法：A组：无Vc 加Lif 诱导，B组：有Vc 加Lif 诱导 --- 能形成很好的对比3 G2 }/ F e! [3 t4 i% x9 K8 R
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二. 总结
' b' U7 |2 e9 v m1. 文章结构紧凑，一环套一环，能相互对比，也能在各组别之间对比，这样讨论的东西就比较多，同时文章的图片拍摄 和 排版也很好。这暗示我们做实验室时就要想好文章的整体思路
: d; a( ], ~6 t7 f2. 文章写的比较诚恳，不夸大，不浮躁，如只得到了部分重编程的干细胞，得到的干细胞克隆不能增殖传代。这些都是值得我们借鉴和学习的
& J4 J/ h9 Z4 ]3. 文章讨论部分： A. 提到了蛋白在细胞培养基中的溶解度问题，这是以前文章中没有提到的; B. 还提到了 加入蛋白三天后，就出现了克隆，他们感觉与其他重编程相比，这个出克隆的时间太快了，不利于细胞的充分重编程，就如一个人跑的太快了容易摔倒，这暗示我们应该降低这个过程，如降低蛋白的浓度，改变因子加入的顺序（c-myc蛋白可能会加速细胞的凋亡）。' q3 C1 F% n$ U8 G# e, q- `2 D- N% w
6 A9 [) y+ Q6 S ~; N' _三. 疑问
6 l7 S: d0 T: l; P2 S( r/ @- d+ W1. 本文中是根据什么确定使用何种MTD的，这些MTD与以前的TAT,9R，11R 又有何种优势？？？自己不是很了解，请高手指点
0 u9 a, a$ ~( z# N) `2. 文中对纯化后的蛋白纯度 和 检测没有说明，文章中只有一张SDS-PAGE图片，并且没有WB图片，虽说做了荧光素酶试验说明了其转录活性
( e( _9 e* ~) u# |* [, G+ }3. 为什么这些AP阳性、表达某些多能性基因的克隆不能增殖呢，这与2012年张慧的文章结果是相似的，他们用重组蛋白介导iPSCs也没有建立稳定的细胞系 对于这一问题大家怎么看？？？
4 \7 t7 T" i1 e$ r4. 我最近也在做原核表达OSKMNL这两种蛋白，然后介导猪的体细胞重编程！！！ 这方面的工作现在也比较多了，套路都差不多，大家能帮我想想还有什么地方，还可以做哪些创新，以便于将来发好文章。
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# J; _# }2 F9 @& y' K2 r欢迎讨论，自己也额外上传了最近5年的几篇蛋白介导重编程的经典文章！！！, e! z% N( i5 E
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补充内容 (2014-3-29 22:10):& D" [) w! U. ^2 O
关于蛋白质介导体细胞重编程:4 ~: D U* n; X7 v. u6 x, ~5 z
1. 蛋白的可溶性与否，这直接关系到蛋白的质量和制取的工作量及成本；
- C4 |. r. \% m) n2. 蛋白质在细胞培养基中的溶解度，如蛋白与细胞共孵育一段时间后，蛋白析出的问题！% o ^2 I$ }7 e8 Q
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补充内容 (2014-3-29 22:16):
* r* t, c+ V9 I- c8 X, M- _3. 蛋白添加的顺序也应该优化，最近裴端卿组有一篇iPSCs诱导过程中EMT-MET的文章（2013.10,月份记不清了），其中c-MYc添加的顺序就是在中间添加的，如果蛋白介导iPSCs也按这样的顺序，是否会出现能增值的克隆呢？？& O. R8 K b0 c3 J
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2 b) D, P5 S% s! R补充内容 (2014-4-6 14:55):
$ U! r6 ]$ A @# i) n; V: s" x- M4 x感谢Xray19 上传的一篇关于“ 重组蛋白维持鸡ESCs多能性”的文章，文章发表在SCIENCE CHINA Life Sciences 上（2013年见刊），有中国农业大学的Ying完成，技术是实验室的常规技术，但文章的起点不错，有创新性！ |
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发表于 2014-3-28 20:37
