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自己一直在做蛋白诱导猪iPSCs的工作，最近看了一篇相关方面的文献，在这里与大家分享下！同时也有以下疑问想下大家请教下，欢迎拍砖！！！, f; |: D q* X( V" E- z: u. O
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题目：Partial Somatic to Stem Cell Transformations Induced By Cell-Permeable Reprogramming Factors 杂志：Nature 下面的SCIENTFI REPORTS , IF 不高，但文章质量还不错，如十几年前 cell 下面的 stem cell， 文章作者为KIM，参考文献中有他的三篇一作SCI论文，推测可能是做蛋白生产、生物治疗和疾病机制等方面工作；这篇文章应该是其第一篇蛋白诱导重编程的文章。 文章的工作量还是不小的，且只有四个作者，还要除去一个通讯作者，文章详见附件！！！
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一. 文章的结构：+ r/ q( p/ _2 B ~
1. 蛋白的制备分为A、B两组：
8 ~3 U+ P+ d- y, |A组: Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc和Nanog（OSKMN） 的编码区亚克隆至Pet28a载体中，同时加上MTD（使重组蛋白入核）, HIS-TAG（利于纯化）, NLS（核定位序列）等序列，获得重组蛋白； 可能由于A组没有针对表达菌株为大肠杆菌进行密码子优化，OSKMN的表达量不高，且是包涵体表达；在此基础上，想获得 更多 和可溶性的 重组蛋白，于是有了B组。
* i5 V2 r6 }4 d' w9 u. _B组: ，对OSKML进行了基因优化，同时根据蛋白的表达量和可溶性表达 筛选了不同的MTD, 但遗憾地是，好像文章后续诱导所用的蛋白为变性条件下的蛋白。9 s, Y+ V0 I! k% u" R$ z$ Q+ V
) }: n$ f/ g& \; N% @9 ?: C1 l4 W2. A组重组蛋白介导的重编程（hES培养体系）：有两种方法：A组：诱导全过程中添加蛋白；B组：间断添加蛋白
# F8 }7 B! d* |. z考虑A组蛋白在与细胞共培养时有析出现象，且Nanog溶解度最低，于是考虑使用B组蛋白介导重编程。; G) d% o/ u# @( j, w) ~8 M# l6 [
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3. B组重组蛋白介导的重编程（偏重于mES培养体系）：也有两中种方法：A组：无Vc 加Lif 诱导，B组：有Vc 加Lif 诱导 --- 能形成很好的对比8 N5 B0 O+ }5 n2 g9 e
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二. 总结! f- g# Q/ C) H. K, @* |
1. 文章结构紧凑，一环套一环，能相互对比，也能在各组别之间对比，这样讨论的东西就比较多，同时文章的图片拍摄 和 排版也很好。这暗示我们做实验室时就要想好文章的整体思路
# o$ o L7 t+ f/ J% \5 ]/ P2. 文章写的比较诚恳，不夸大，不浮躁，如只得到了部分重编程的干细胞，得到的干细胞克隆不能增殖传代。这些都是值得我们借鉴和学习的
" R1 ]8 z4 m1 c& r0 Z5 e4 a. M3. 文章讨论部分： A. 提到了蛋白在细胞培养基中的溶解度问题，这是以前文章中没有提到的; B. 还提到了 加入蛋白三天后，就出现了克隆，他们感觉与其他重编程相比，这个出克隆的时间太快了，不利于细胞的充分重编程，就如一个人跑的太快了容易摔倒，这暗示我们应该降低这个过程，如降低蛋白的浓度，改变因子加入的顺序（c-myc蛋白可能会加速细胞的凋亡）。
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4 C& O( `5 ^: A. O3 J+ _# _三. 疑问
0 j( q2 E) J; X$ ]' s8 E2 j. M1. 本文中是根据什么确定使用何种MTD的，这些MTD与以前的TAT,9R，11R 又有何种优势？？？自己不是很了解，请高手指点
' i' \! m( C4 Y, {( y; [9 m2. 文中对纯化后的蛋白纯度 和 检测没有说明，文章中只有一张SDS-PAGE图片，并且没有WB图片，虽说做了荧光素酶试验说明了其转录活性
4 y- P0 s2 Q, E3. 为什么这些AP阳性、表达某些多能性基因的克隆不能增殖呢，这与2012年张慧的文章结果是相似的，他们用重组蛋白介导iPSCs也没有建立稳定的细胞系 对于这一问题大家怎么看？？？
& \& t8 m3 T( `7 W( E4. 我最近也在做原核表达OSKMNL这两种蛋白，然后介导猪的体细胞重编程！！！ 这方面的工作现在也比较多了，套路都差不多，大家能帮我想想还有什么地方，还可以做哪些创新，以便于将来发好文章。
1 A- F; E0 r. a" G' h k+ x+ d$ _0 m' u* d! T/ g8 d
欢迎讨论，自己也额外上传了最近5年的几篇蛋白介导重编程的经典文章！！！2 ?: T2 h+ J0 D8 p
2 i4 |2 {9 n6 g" U: [ M
" ^# I6 F, {3 m# v. |3 X4 H补充内容 (2014-3-29 22:10):7 {2 m3 D$ r% v3 c6 n( ?
关于蛋白质介导体细胞重编程:
- E) }# p. |& e. t8 W1. 蛋白的可溶性与否，这直接关系到蛋白的质量和制取的工作量及成本；
2 G9 j/ ? J" Y: O; O# I0 H2. 蛋白质在细胞培养基中的溶解度，如蛋白与细胞共孵育一段时间后，蛋白析出的问题！
& B1 `' D6 H; A: l$ X' V
+ ?. ? e4 Z, H; p' o补充内容 (2014-3-29 22:16):
3 E( H q8 Z3 y9 Z" Q) _) S9 I1 O2 m q3. 蛋白添加的顺序也应该优化，最近裴端卿组有一篇iPSCs诱导过程中EMT-MET的文章（2013.10,月份记不清了），其中c-MYc添加的顺序就是在中间添加的，如果蛋白介导iPSCs也按这样的顺序，是否会出现能增值的克隆呢？？
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9 M% I6 J! }- E8 G: h9 W补充内容 (2014-4-6 14:55):1 l7 r u' R8 P# q4 \' m
感谢Xray19 上传的一篇关于“ 重组蛋白维持鸡ESCs多能性”的文章，文章发表在SCIENCE CHINA Life Sciences 上（2013年见刊），有中国农业大学的Ying完成，技术是实验室的常规技术，但文章的起点不错，有创新性！ |
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发表于 2014-3-28 20:37
