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自己一直在做蛋白诱导猪iPSCs的工作，最近看了一篇相关方面的文献，在这里与大家分享下！同时也有以下疑问想下大家请教下，欢迎拍砖！！！
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: H% H' o! j8 _' O- v题目：Partial Somatic to Stem Cell Transformations Induced By Cell-Permeable Reprogramming Factors 杂志：Nature 下面的SCIENTFI REPORTS , IF 不高，但文章质量还不错，如十几年前 cell 下面的 stem cell， 文章作者为KIM，参考文献中有他的三篇一作SCI论文，推测可能是做蛋白生产、生物治疗和疾病机制等方面工作；这篇文章应该是其第一篇蛋白诱导重编程的文章。 文章的工作量还是不小的，且只有四个作者，还要除去一个通讯作者，文章详见附件！！！ / w/ h2 p, ]4 c+ u9 [2 W; D
Y1 ]3 V0 r$ ?+ y) n2 O) [9 J一. 文章的结构：6 l' } Z) f8 u( C
1. 蛋白的制备分为A、B两组：
2 ^/ h: n5 Q/ `+ ^7 ]9 b- mA组: Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc和Nanog（OSKMN） 的编码区亚克隆至Pet28a载体中，同时加上MTD（使重组蛋白入核）, HIS-TAG（利于纯化）, NLS（核定位序列）等序列，获得重组蛋白； 可能由于A组没有针对表达菌株为大肠杆菌进行密码子优化，OSKMN的表达量不高，且是包涵体表达；在此基础上，想获得 更多 和可溶性的 重组蛋白，于是有了B组。9 g, Q3 q7 I# l; Q$ r& ^9 O- Z* h
B组: ，对OSKML进行了基因优化，同时根据蛋白的表达量和可溶性表达 筛选了不同的MTD, 但遗憾地是，好像文章后续诱导所用的蛋白为变性条件下的蛋白。) c: X0 l6 L% K! M
+ N- E7 C% m1 C) l2. A组重组蛋白介导的重编程（hES培养体系）：有两种方法：A组：诱导全过程中添加蛋白；B组：间断添加蛋白
/ f& V O$ ?+ ~, N0 y# N考虑A组蛋白在与细胞共培养时有析出现象，且Nanog溶解度最低，于是考虑使用B组蛋白介导重编程。
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8 k# Y3 T. o8 R% Q- N9 U- O3. B组重组蛋白介导的重编程（偏重于mES培养体系）：也有两中种方法：A组：无Vc 加Lif 诱导，B组：有Vc 加Lif 诱导 --- 能形成很好的对比$ |* f* W3 M/ M- \& ^
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二. 总结3 M2 z; d, V! a- ^/ r
1. 文章结构紧凑，一环套一环，能相互对比，也能在各组别之间对比，这样讨论的东西就比较多，同时文章的图片拍摄 和 排版也很好。这暗示我们做实验室时就要想好文章的整体思路8 N9 s2 a3 i* A( o. U% [) G5 A
2. 文章写的比较诚恳，不夸大，不浮躁，如只得到了部分重编程的干细胞，得到的干细胞克隆不能增殖传代。这些都是值得我们借鉴和学习的
! I4 v' Z$ c; P+ L, Z3. 文章讨论部分： A. 提到了蛋白在细胞培养基中的溶解度问题，这是以前文章中没有提到的; B. 还提到了 加入蛋白三天后，就出现了克隆，他们感觉与其他重编程相比，这个出克隆的时间太快了，不利于细胞的充分重编程，就如一个人跑的太快了容易摔倒，这暗示我们应该降低这个过程，如降低蛋白的浓度，改变因子加入的顺序（c-myc蛋白可能会加速细胞的凋亡）。
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三. 疑问7 w Q" U4 l- n; T x
1. 本文中是根据什么确定使用何种MTD的，这些MTD与以前的TAT,9R，11R 又有何种优势？？？自己不是很了解，请高手指点
8 Q; E) R/ P6 | l) c! \* t/ G2. 文中对纯化后的蛋白纯度 和 检测没有说明，文章中只有一张SDS-PAGE图片，并且没有WB图片，虽说做了荧光素酶试验说明了其转录活性. |" B2 ?: \3 D7 C# ?. C/ {
3. 为什么这些AP阳性、表达某些多能性基因的克隆不能增殖呢，这与2012年张慧的文章结果是相似的，他们用重组蛋白介导iPSCs也没有建立稳定的细胞系 对于这一问题大家怎么看？？？( g- I5 k# O4 W6 H* m0 a$ n
4. 我最近也在做原核表达OSKMNL这两种蛋白，然后介导猪的体细胞重编程！！！ 这方面的工作现在也比较多了，套路都差不多，大家能帮我想想还有什么地方，还可以做哪些创新，以便于将来发好文章。
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欢迎讨论，自己也额外上传了最近5年的几篇蛋白介导重编程的经典文章！！！ q$ _& P3 W) |/ F; k- n' }
0 c, [% ~- P) w; m) P
% z5 E9 D" p7 W' S( z补充内容 (2014-3-29 22:10):
: ~# o* W& X G# B# o关于蛋白质介导体细胞重编程:( `5 H) \2 C& y# d) z
1. 蛋白的可溶性与否，这直接关系到蛋白的质量和制取的工作量及成本；% @* G* ~3 W7 K+ \, T/ t
2. 蛋白质在细胞培养基中的溶解度，如蛋白与细胞共孵育一段时间后，蛋白析出的问题！( a5 S! x/ J3 M+ f1 e2 a
6 P# s: D k9 ~
补充内容 (2014-3-29 22:16):
- j6 F- H$ R* L9 D, C: Z; Z3. 蛋白添加的顺序也应该优化，最近裴端卿组有一篇iPSCs诱导过程中EMT-MET的文章（2013.10,月份记不清了），其中c-MYc添加的顺序就是在中间添加的，如果蛋白介导iPSCs也按这样的顺序，是否会出现能增值的克隆呢？？) ?3 `0 d" P _$ {3 l
- j) j% F* p1 ^# i0 \% {# J4 F. Z/ q4 U1 f5 U# Q5 Q
补充内容 (2014-4-6 14:55):3 E( j$ E6 U" a( ]5 o
感谢Xray19 上传的一篇关于“ 重组蛋白维持鸡ESCs多能性”的文章，文章发表在SCIENCE CHINA Life Sciences 上（2013年见刊），有中国农业大学的Ying完成，技术是实验室的常规技术，但文章的起点不错，有创新性！ |
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发表于 2014-3-28 20:37
