2014年 Nature scientific reports上的一篇关于“重组蛋白诱导iPSCs”的读后感

Andyhigh

自己一直在做蛋白诱导猪iPSCs的工作，最近看了一篇相关方面的文献，在这里与大家分享下！同时也有以下疑问想下大家请教下，欢迎拍砖！！！8 D1 ]8 F1 j# p! e
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题目：Partial Somatic to Stem Cell Transformations Induced By Cell-Permeable Reprogramming Factors  杂志：Nature 下面的SCIENTFI REPORTS , IF 不高，但文章质量还不错，如十几年前 cell 下面的 stem cell， 文章作者为KIM，参考文献中有他的三篇一作SCI论文，推测可能是做蛋白生产、生物治疗和疾病机制等方面工作；这篇文章应该是其第一篇蛋白诱导重编程的文章。 文章的工作量还是不小的，且只有四个作者，还要除去一个通讯作者，文章详见附件！！！
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. Q  D1 }  }6 R: r) ?4 B一. 文章的结构：
/ g: G. V( c1 g! d1. 蛋白的制备分为A、B两组：3 F  D4 E1 n9 T4 E
A组: Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc和Nanog（OSKMN） 的编码区亚克隆至Pet28a载体中，同时加上MTD（使重组蛋白入核）, HIS-TAG（利于纯化）, NLS（核定位序列）等序列，获得重组蛋白；  可能由于A组没有针对表达菌株为大肠杆菌进行密码子优化，OSKMN的表达量不高，且是包涵体表达；在此基础上，想获得 更多 和可溶性的 重组蛋白，于是有了B组。
+ _0 H+ m' j# e2 z& o  z6 Y* e9 KB组: ，对OSKML进行了基因优化，同时根据蛋白的表达量和可溶性表达 筛选了不同的MTD, 但遗憾地是，好像文章后续诱导所用的蛋白为变性条件下的蛋白。- ~! T% O1 S# n4 T

2 ]/ O* E" h+ V& e% M9 t2. A组重组蛋白介导的重编程（hES培养体系）：有两种方法：A组：诱导全过程中添加蛋白；B组：间断添加蛋白3 `5 Z6 J, N1 g
考虑A组蛋白在与细胞共培养时有析出现象，且Nanog溶解度最低，于是考虑使用B组蛋白介导重编程。. E, C! Y5 x- w0 o0 c) B% H
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3. B组重组蛋白介导的重编程（偏重于mES培养体系）：也有两中种方法：A组：无Vc 加Lif 诱导，B组：有Vc 加Lif 诱导 --- 能形成很好的对比9 k. A5 ^: ?6 [1 [

$ X' [" G' g; j8 u9 |/ C  T二. 总结4 F! B! U% W; k% @  P8 T
1. 文章结构紧凑，一环套一环，能相互对比，也能在各组别之间对比，这样讨论的东西就比较多，同时文章的图片拍摄 和 排版也很好。这暗示我们做实验室时就要想好文章的整体思路
' c3 z1 @" y3 o. Z. }( E2. 文章写的比较诚恳，不夸大，不浮躁，如只得到了部分重编程的干细胞，得到的干细胞克隆不能增殖传代。这些都是值得我们借鉴和学习的
) ]' V. b# ?7 `$ y. O3. 文章讨论部分： A. 提到了蛋白在细胞培养基中的溶解度问题，这是以前文章中没有提到的;  B. 还提到了 加入蛋白三天后，就出现了克隆，他们感觉与其他重编程相比，这个出克隆的时间太快了，不利于细胞的充分重编程，就如一个人跑的太快了容易摔倒，这暗示我们应该降低这个过程，如降低蛋白的浓度，改变因子加入的顺序（c-myc蛋白可能会加速细胞的凋亡）。$ N$ r# Z  Y  I9 @% M3 U

' H$ H# C6 j: c, n  x三. 疑问% Q3 D$ l$ H  q! `
1. 本文中是根据什么确定使用何种MTD的，这些MTD与以前的TAT,9R，11R 又有何种优势？？？自己不是很了解，请高手指点
8 x, W  e" x* w2 X: ?- ~2. 文中对纯化后的蛋白纯度 和 检测没有说明，文章中只有一张SDS-PAGE图片，并且没有WB图片，虽说做了荧光素酶试验说明了其转录活性: m6 q5 [+ E/ W5 @; M
3. 为什么这些AP阳性、表达某些多能性基因的克隆不能增殖呢，这与2012年张慧的文章结果是相似的，他们用重组蛋白介导iPSCs也没有建立稳定的细胞系  对于这一问题大家怎么看？？？
" c: i3 Y+ A) o- M9 X1 n4. 我最近也在做原核表达OSKMNL这两种蛋白，然后介导猪的体细胞重编程！！！   这方面的工作现在也比较多了，套路都差不多，大家能帮我想想还有什么地方，还可以做哪些创新，以便于将来发好文章。   - Y% w7 {$ x! Y5 R$ t5 y8 a

3 v  v* A8 I5 c8 F欢迎讨论，自己也额外上传了最近5年的几篇蛋白介导重编程的经典文章！！！
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: C9 {3 V& f* m  y0 S% w
补充内容 (2014-3-29 22:10):9 `0 P& v1 A) l1 a' g5 z0 r$ Z9 G
关于蛋白质介导体细胞重编程:, t; z& V1 f5 Q1 q
1. 蛋白的可溶性与否，这直接关系到蛋白的质量和制取的工作量及成本；
8 ]: M# a1 {& m7 i$ [( G- J5 e2. 蛋白质在细胞培养基中的溶解度，如蛋白与细胞共孵育一段时间后，蛋白析出的问题！* Z9 c' Y# D3 t+ [% w% j4 S! ]

& J: H8 f* p9 m. S& M补充内容 (2014-3-29 22:16):# R- `  O& B$ s( d: N
3. 蛋白添加的顺序也应该优化，最近裴端卿组有一篇iPSCs诱导过程中EMT-MET的文章（2013.10,月份记不清了），其中c-MYc添加的顺序就是在中间添加的，如果蛋白介导iPSCs也按这样的顺序，是否会出现能增值的克隆呢？？& l3 Q/ @4 J. P' i

; _) A) A2 M# s3 P" Z+ Y5 h& b4 D- r
3 N$ z( }7 L+ \9 L8 \/ b0 ~补充内容 (2014-4-6 14:55):- J/ J9 ?2 N7 i& M9 M
感谢Xray19 上传的一篇关于“ 重组蛋白维持鸡ESCs多能性”的文章，文章发表在SCIENCE CHINA Life Sciences 上（2013年见刊），有中国农业大学的Ying完成，技术是实验室的常规技术，但文章的起点不错，有创新性！

Andyhigh

Damon-Salvatore

我有一个老师10年发了篇用TAT引导OSMK进入细胞进行重编程的文章，但是由于重组蛋白进入细胞后，滞留在内含体内，效果并不是太好。原文如下：* b; \6 b! R* @* R1 f. u3 }
( q9 J6 O4 H: u1 N4 y

; n( r4 A& g: ^- ]补充内容 (2014-3-29 08:45):0 Z: \  ?" j- s# k% v0 h
剩余的希望大家多多指点

Andyhigh

回复 Damon-Salvatore 的帖子8 G' C- F' ^8 F8 l# \5 Q& e
9 p, Q" q/ f* M
这篇文章看过了，你现在还在西北农林嘛？

Damon-Salvatore

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$ d3 v5 b0 \3 C7 z2 T) ~4 f4 S; d# d. [$ I+ V' J
嗯 现在大三。前辈现在在什么单位呢？

Andyhigh

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/ J+ x$ z5 J$ h" K# }0 Z# i% r% x) |9 _9 L, c/ ^
在安农大读研究生，你也算是个牛人啊，我大三都不知道在干啥呢！

Andyhigh

回复 Damon-Salvatore 的帖子' |9 W' i8 v  C( V$ H

. U2 w' u) F# w  X5 d; U- T第34届国际动物遗传学大会今年七月底在 西安 举办，  这个会议你可以关注下% c7 k# N' i0 e* r
链接：http://www.isag2014.com/plus/list.php?tid=29

Damon-Salvatore

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! X) @1 `0 L: w2 E4 q
4 E$ i& @7 a% ~4 P- \+ o3 e0 y恩 谢谢前辈。这种会议是在什么地方找到的呢？亏我还在西安附近，这些都不知道。是在科学网还是？

Andyhigh

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5 ]. k7 w3 ?4 y3 L是去年在成都开会，李宁院士在会上 把这个会做了一个广告，之后就一直留意了下，07年诺比尔奖得主 Mario Capecchi 教授也出席这个会议；这些东西是朋友多了，圈子大了，也就知道了！

Andyhigh

关于EMT-MET的文章：