2014年 Nature scientific reports上的一篇关于“重组蛋白诱导iPSCs”的读后感

Andyhigh

自己一直在做蛋白诱导猪iPSCs的工作，最近看了一篇相关方面的文献，在这里与大家分享下！同时也有以下疑问想下大家请教下，欢迎拍砖！！！
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6 y6 P9 n( l3 O" [+ g4 E; F. t题目：Partial Somatic to Stem Cell Transformations Induced By Cell-Permeable Reprogramming Factors  杂志：Nature 下面的SCIENTFI REPORTS , IF 不高，但文章质量还不错，如十几年前 cell 下面的 stem cell， 文章作者为KIM，参考文献中有他的三篇一作SCI论文，推测可能是做蛋白生产、生物治疗和疾病机制等方面工作；这篇文章应该是其第一篇蛋白诱导重编程的文章。 文章的工作量还是不小的，且只有四个作者，还要除去一个通讯作者，文章详见附件！！！ ' X- q, W. y! v6 V+ D" ~" j
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一. 文章的结构：2 a$ P, ]1 ~, \- y
1. 蛋白的制备分为A、B两组：
" A, V# n  d5 [( N1 h" N' VA组: Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc和Nanog（OSKMN） 的编码区亚克隆至Pet28a载体中，同时加上MTD（使重组蛋白入核）, HIS-TAG（利于纯化）, NLS（核定位序列）等序列，获得重组蛋白；  可能由于A组没有针对表达菌株为大肠杆菌进行密码子优化，OSKMN的表达量不高，且是包涵体表达；在此基础上，想获得 更多 和可溶性的 重组蛋白，于是有了B组。
9 ?! ]2 O! o: _) _. p$ t2 k* T4 Y( zB组: ，对OSKML进行了基因优化，同时根据蛋白的表达量和可溶性表达 筛选了不同的MTD, 但遗憾地是，好像文章后续诱导所用的蛋白为变性条件下的蛋白。
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) b' g0 }! Z' f; c4 H5 D2. A组重组蛋白介导的重编程（hES培养体系）：有两种方法：A组：诱导全过程中添加蛋白；B组：间断添加蛋白
, z! u4 D( b$ ^2 o3 e# B考虑A组蛋白在与细胞共培养时有析出现象，且Nanog溶解度最低，于是考虑使用B组蛋白介导重编程。) L( _' F9 C5 C3 L. V) Y- a5 V" F$ d

" X' `6 K( v& p; L+ a8 C4 L3. B组重组蛋白介导的重编程（偏重于mES培养体系）：也有两中种方法：A组：无Vc 加Lif 诱导，B组：有Vc 加Lif 诱导 --- 能形成很好的对比
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8 o0 Y3 J% J& i二. 总结9 j; ^; o$ \( G* z& J; J
1. 文章结构紧凑，一环套一环，能相互对比，也能在各组别之间对比，这样讨论的东西就比较多，同时文章的图片拍摄 和 排版也很好。这暗示我们做实验室时就要想好文章的整体思路. u8 [- s+ v: U4 W
2. 文章写的比较诚恳，不夸大，不浮躁，如只得到了部分重编程的干细胞，得到的干细胞克隆不能增殖传代。这些都是值得我们借鉴和学习的1 S+ N# {; B5 l# p0 i/ z' }& g( h7 e
3. 文章讨论部分： A. 提到了蛋白在细胞培养基中的溶解度问题，这是以前文章中没有提到的;  B. 还提到了 加入蛋白三天后，就出现了克隆，他们感觉与其他重编程相比，这个出克隆的时间太快了，不利于细胞的充分重编程，就如一个人跑的太快了容易摔倒，这暗示我们应该降低这个过程，如降低蛋白的浓度，改变因子加入的顺序（c-myc蛋白可能会加速细胞的凋亡）。
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三. 疑问6 j( ^$ L& L; G/ o9 G: E; N: Q
1. 本文中是根据什么确定使用何种MTD的，这些MTD与以前的TAT,9R，11R 又有何种优势？？？自己不是很了解，请高手指点- z8 S( p, h1 z+ o) z
2. 文中对纯化后的蛋白纯度 和 检测没有说明，文章中只有一张SDS-PAGE图片，并且没有WB图片，虽说做了荧光素酶试验说明了其转录活性3 Z0 ]6 Q# ]0 \9 {* [& K3 t
3. 为什么这些AP阳性、表达某些多能性基因的克隆不能增殖呢，这与2012年张慧的文章结果是相似的，他们用重组蛋白介导iPSCs也没有建立稳定的细胞系  对于这一问题大家怎么看？？？9 c) G0 p2 ]/ `1 e6 N( c
4. 我最近也在做原核表达OSKMNL这两种蛋白，然后介导猪的体细胞重编程！！！   这方面的工作现在也比较多了，套路都差不多，大家能帮我想想还有什么地方，还可以做哪些创新，以便于将来发好文章。   
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欢迎讨论，自己也额外上传了最近5年的几篇蛋白介导重编程的经典文章！！！4 F7 g3 g5 [- _; D
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补充内容 (2014-3-29 22:10):, V4 y; M; z* B2 n4 ^  T1 J& J6 X
关于蛋白质介导体细胞重编程:6 V9 e: W  @/ h9 C. \! u+ z
1. 蛋白的可溶性与否，这直接关系到蛋白的质量和制取的工作量及成本；2 Y. j6 {% i0 U$ G$ W
2. 蛋白质在细胞培养基中的溶解度，如蛋白与细胞共孵育一段时间后，蛋白析出的问题！" q/ u, [* C  \( y

* j/ x: b/ O% z4 B$ G补充内容 (2014-3-29 22:16):
) v9 K. R* I* D6 c- Q: I7 ?3. 蛋白添加的顺序也应该优化，最近裴端卿组有一篇iPSCs诱导过程中EMT-MET的文章（2013.10,月份记不清了），其中c-MYc添加的顺序就是在中间添加的，如果蛋白介导iPSCs也按这样的顺序，是否会出现能增值的克隆呢？？# ?8 V. F. b: N7 L& p: X1 H/ x
% ]6 S( w$ `; E3 D/ t" _

/ N& U/ f1 i/ Z9 f, j0 E4 ]& U. }' [补充内容 (2014-4-6 14:55):" V" j2 ?" x) [* S. \2 T
感谢Xray19 上传的一篇关于“ 重组蛋白维持鸡ESCs多能性”的文章，文章发表在SCIENCE CHINA Life Sciences 上（2013年见刊），有中国农业大学的Ying完成，技术是实验室的常规技术，但文章的起点不错，有创新性！

Andyhigh

Damon-Salvatore

我有一个老师10年发了篇用TAT引导OSMK进入细胞进行重编程的文章，但是由于重组蛋白进入细胞后，滞留在内含体内，效果并不是太好。原文如下：( Q5 ?# ?5 N6 c; |5 Y2 s

3 v7 ]7 b6 S2 x* M: Y& g8 f3 u
9 o. w+ |! M) c& @补充内容 (2014-3-29 08:45):& |3 a% e, f8 Y2 [
剩余的希望大家多多指点

Andyhigh

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4 m; Y4 e1 v$ h7 {% g5 H
) C  c3 @, r  k这篇文章看过了，你现在还在西北农林嘛？

Damon-Salvatore

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) ?) n1 J6 C, X# N! G
" V$ D. i/ P" E3 F* n" k. {嗯 现在大三。前辈现在在什么单位呢？

Andyhigh

回复 Damon-Salvatore 的帖子5 I& l! z& @/ X+ M' V- P
, M) l% l4 X9 ^/ M% m, P1 o
在安农大读研究生，你也算是个牛人啊，我大三都不知道在干啥呢！

Andyhigh

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/ q/ \' k! ^$ b/ L+ ]+ a; }. {/ _0 _3 J5 |& [' l: I
第34届国际动物遗传学大会今年七月底在 西安 举办，  这个会议你可以关注下. |5 l/ J) ~  e0 n0 _8 s
链接：http://www.isag2014.com/plus/list.php?tid=29

Damon-Salvatore

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. B, u; ~, R1 Y8 E" Z5 C  n
( l; v* G6 X; g恩 谢谢前辈。这种会议是在什么地方找到的呢？亏我还在西安附近，这些都不知道。是在科学网还是？

Andyhigh

回复 Damon-Salvatore 的帖子1 w/ o3 i8 k' k) X  X

9 e% c3 ?  T! n) z3 m  O  ~+ `是去年在成都开会，李宁院士在会上 把这个会做了一个广告，之后就一直留意了下，07年诺比尔奖得主 Mario Capecchi 教授也出席这个会议；这些东西是朋友多了，圈子大了，也就知道了！

Andyhigh

关于EMT-MET的文章：