2014年 Nature scientific reports上的一篇关于“重组蛋白诱导iPSCs”的读后感

Andyhigh

自己一直在做蛋白诱导猪iPSCs的工作，最近看了一篇相关方面的文献，在这里与大家分享下！同时也有以下疑问想下大家请教下，欢迎拍砖！！！
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6 l% i0 S% h, C$ ]题目：Partial Somatic to Stem Cell Transformations Induced By Cell-Permeable Reprogramming Factors  杂志：Nature 下面的SCIENTFI REPORTS , IF 不高，但文章质量还不错，如十几年前 cell 下面的 stem cell， 文章作者为KIM，参考文献中有他的三篇一作SCI论文，推测可能是做蛋白生产、生物治疗和疾病机制等方面工作；这篇文章应该是其第一篇蛋白诱导重编程的文章。 文章的工作量还是不小的，且只有四个作者，还要除去一个通讯作者，文章详见附件！！！
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9 U9 ~; m! r+ A% ]1 h一. 文章的结构：
/ U1 X  i$ [" N1 t1. 蛋白的制备分为A、B两组：& X+ v. b  R7 f; h$ i1 y7 m! f
A组: Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc和Nanog（OSKMN） 的编码区亚克隆至Pet28a载体中，同时加上MTD（使重组蛋白入核）, HIS-TAG（利于纯化）, NLS（核定位序列）等序列，获得重组蛋白；  可能由于A组没有针对表达菌株为大肠杆菌进行密码子优化，OSKMN的表达量不高，且是包涵体表达；在此基础上，想获得 更多 和可溶性的 重组蛋白，于是有了B组。
$ o' v  q9 M+ r  j7 Z& _) iB组: ，对OSKML进行了基因优化，同时根据蛋白的表达量和可溶性表达 筛选了不同的MTD, 但遗憾地是，好像文章后续诱导所用的蛋白为变性条件下的蛋白。. L. F9 I% `7 J& x) N: Z/ W8 @0 J+ C, B

  _. ~' }; E$ i9 ~+ r2 M0 \2. A组重组蛋白介导的重编程（hES培养体系）：有两种方法：A组：诱导全过程中添加蛋白；B组：间断添加蛋白
. L; v- Z8 q* N8 ~3 h考虑A组蛋白在与细胞共培养时有析出现象，且Nanog溶解度最低，于是考虑使用B组蛋白介导重编程。! ^1 [/ O1 W, N/ |, T. t, T+ H

" g6 f% I9 x2 I# g3. B组重组蛋白介导的重编程（偏重于mES培养体系）：也有两中种方法：A组：无Vc 加Lif 诱导，B组：有Vc 加Lif 诱导 --- 能形成很好的对比
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二. 总结
/ _" g" ~. X* e: [7 P1. 文章结构紧凑，一环套一环，能相互对比，也能在各组别之间对比，这样讨论的东西就比较多，同时文章的图片拍摄 和 排版也很好。这暗示我们做实验室时就要想好文章的整体思路* p; K: {; {1 W' H/ L! g
2. 文章写的比较诚恳，不夸大，不浮躁，如只得到了部分重编程的干细胞，得到的干细胞克隆不能增殖传代。这些都是值得我们借鉴和学习的3 [6 z2 m# }! L) B) E8 u
3. 文章讨论部分： A. 提到了蛋白在细胞培养基中的溶解度问题，这是以前文章中没有提到的;  B. 还提到了 加入蛋白三天后，就出现了克隆，他们感觉与其他重编程相比，这个出克隆的时间太快了，不利于细胞的充分重编程，就如一个人跑的太快了容易摔倒，这暗示我们应该降低这个过程，如降低蛋白的浓度，改变因子加入的顺序（c-myc蛋白可能会加速细胞的凋亡）。% M- y+ ~* V; e1 y
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三. 疑问
( |9 {, ]- {! T- F1. 本文中是根据什么确定使用何种MTD的，这些MTD与以前的TAT,9R，11R 又有何种优势？？？自己不是很了解，请高手指点: c! a. k# ?8 c5 \
2. 文中对纯化后的蛋白纯度 和 检测没有说明，文章中只有一张SDS-PAGE图片，并且没有WB图片，虽说做了荧光素酶试验说明了其转录活性" q1 E+ L- m5 z1 M. T5 Z
3. 为什么这些AP阳性、表达某些多能性基因的克隆不能增殖呢，这与2012年张慧的文章结果是相似的，他们用重组蛋白介导iPSCs也没有建立稳定的细胞系  对于这一问题大家怎么看？？？
2 a$ |1 p! a0 b! u: _- e" D; r4. 我最近也在做原核表达OSKMNL这两种蛋白，然后介导猪的体细胞重编程！！！   这方面的工作现在也比较多了，套路都差不多，大家能帮我想想还有什么地方，还可以做哪些创新，以便于将来发好文章。   : a8 {% y/ j% M, L% `$ v8 m' W! k

1 Q) g( y$ r" a; O. t6 Y& g' n3 z1 T欢迎讨论，自己也额外上传了最近5年的几篇蛋白介导重编程的经典文章！！！) U9 R8 ]" Q$ E4 a

' j% s, Q8 p* c5 t
6 s0 K* c: x1 y) j补充内容 (2014-3-29 22:10):
2 `% _0 B1 ?" s  O0 X1 |, F) a关于蛋白质介导体细胞重编程:
' j. I5 f$ a6 m, E1. 蛋白的可溶性与否，这直接关系到蛋白的质量和制取的工作量及成本；
% r( F7 c. j1 W" E7 Z4 l2. 蛋白质在细胞培养基中的溶解度，如蛋白与细胞共孵育一段时间后，蛋白析出的问题！3 j7 o% ]; E0 T/ V# M

  d: Z. m  j( M9 Y  W2 z, z补充内容 (2014-3-29 22:16):
" b& V- B' o5 T8 k1 b3. 蛋白添加的顺序也应该优化，最近裴端卿组有一篇iPSCs诱导过程中EMT-MET的文章（2013.10,月份记不清了），其中c-MYc添加的顺序就是在中间添加的，如果蛋白介导iPSCs也按这样的顺序，是否会出现能增值的克隆呢？？
) ~- z- s/ L. H; t4 k( n2 F: Y$ y( b9 ]: H% d8 @

/ f8 ]! W/ P8 }. j. g0 P) [8 L补充内容 (2014-4-6 14:55):5 `  r9 ?6 }4 L
感谢Xray19 上传的一篇关于“ 重组蛋白维持鸡ESCs多能性”的文章，文章发表在SCIENCE CHINA Life Sciences 上（2013年见刊），有中国农业大学的Ying完成，技术是实验室的常规技术，但文章的起点不错，有创新性！

Andyhigh

Damon-Salvatore

我有一个老师10年发了篇用TAT引导OSMK进入细胞进行重编程的文章，但是由于重组蛋白进入细胞后，滞留在内含体内，效果并不是太好。原文如下：
% j* f. W4 R4 C3 {# [
: m' h$ f1 S1 [  w' V& _4 T
8 v" W# o0 `5 a) W* V& \补充内容 (2014-3-29 08:45):1 d7 G# E/ W+ l# P7 C# ~
剩余的希望大家多多指点

Andyhigh

回复 Damon-Salvatore 的帖子7 m2 f7 Q# P7 p% z; R
) h, l- L9 c3 C2 ]
这篇文章看过了，你现在还在西北农林嘛？

Damon-Salvatore

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/ S6 }) ^& p1 e; Q/ J1 [6 s7 Y
嗯 现在大三。前辈现在在什么单位呢？

Andyhigh

回复 Damon-Salvatore 的帖子1 ~  |/ |6 t' U/ M0 S: O
3 ~; e! D  Y- J$ w! o$ N
在安农大读研究生，你也算是个牛人啊，我大三都不知道在干啥呢！

Andyhigh

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/ E4 V( j, A. g+ z7 O/ ]* |3 d7 I; Q, Y
第34届国际动物遗传学大会今年七月底在 西安 举办，  这个会议你可以关注下
1 G' B4 W4 B5 q& u- N链接：http://www.isag2014.com/plus/list.php?tid=29

Damon-Salvatore

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  M) t1 M/ G( _# x7 z* c
' b5 D6 r) }) f恩 谢谢前辈。这种会议是在什么地方找到的呢？亏我还在西安附近，这些都不知道。是在科学网还是？

Andyhigh

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2 l5 L' h5 |4 Y% J6 U, G1 e) h2 H' m" Z2 c2 G: g" @3 m
是去年在成都开会，李宁院士在会上 把这个会做了一个广告，之后就一直留意了下，07年诺比尔奖得主 Mario Capecchi 教授也出席这个会议；这些东西是朋友多了，圈子大了，也就知道了！

Andyhigh

关于EMT-MET的文章：