PBMC没有分离出来

momoenn

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今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个核细胞。大侠们遇到过这种情况吗？在线等待。

Andyhigh

momoenn 发表于 2014-4-3 21:39 ) F/ f! a; p+ H+ b# s
今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个 ...

+ T7 P- D/ N0 `7 V. k3 L能分享下protocol不，大家讨论下看问题出在哪了，我对这方面比较感兴趣！) N( Y0 d7 I  p# r! M

8 c1 y: M# Y4 F$ ^3 Q  Y3 F" f0 }首先上传一份我做小鼠脾脏淋巴细胞分离的方案，可能与你的不太一样：
7 L- j2 T; T; p3 ?0 B
& N, z6 j' ]4 \/ F, R一、        溶液配制$ V( u& ~( j. x+ z( c5 w
1.  1.5M Nacl的配制：4.4g Nacl+50ml蒸馏水 充分溶解后过滤除菌。
4 h7 h0 A- X1 Y1 I1 k2.  0.15M Nacl的配制：去5ml 的1.5M Nacl，加45ml的蒸馏水稀释  g1 Y6 d# ?% x* d
3、100%Percoll (6ml)： 5.4 mlPercoll母液+0.6 ml 1.5M Nacl溶液
+ `( e% ^' D- u# B" A* P. o; h% z4、70% Percoll (6ml) :  4.2 ml100% Percoll+1.8 ml0.15M的Nacl 溶液。/ [+ a5 s5 i+ g% B% U! M" ?% P
6、40%Percoll (3 ml)   1.2 ml100% Percoll+1.8 ml 0.15M Nacl 溶液。
( _; I" [8 {( d9 c7、        红细胞裂解液：索莱宝R1010。
9 a: v% B" n1 |3 c  Q1 g' h8、        6~8周龄雌鼠
( b* S4 z7 a0 u2 f; l/ C7 A) K/ h7 e9、        洗液：95% RPMI 1640+5% FBS +10 mM Hepes
; H1 ]% _: t* U+ I- C% Q10、        增殖培养基：90% RPMI 1640+10% FBS +10 mM Hepes+双抗+2.5ug/ml ConA
2 ?% T1 ]8 |# E# h% z( q" E二 . 小鼠淋巴细胞的获取：
; r- p3 b$ {: U( W1 c- s" C1、断颈处死小鼠，浸泡 于 75% 的乙醇中。
5 S% ]8 @* N3 u& c( b1 y# E# j  g2、在超净台中取出小鼠脾脏，将脾脏在预冷的洗液中洗1遍。4 h- y* \& ^% r' ~  w
3、将脾脏转移至一个干净的6cm皿中，加入4ml预冷的洗液，皿放置于冰盒上，将10ml的注射器针头折弯成150度角。* c5 J( e$ O6 P( b$ h! }
4. 先用针头在脾脏上扎孔，再用镊子固定脾脏，用针头挤压脾脏，将其中的细胞释放出来。' r* g3 m1 C5 v0 F' R3 w) v" O; E
5.. 将收集到的细胞悬液用200目的纱布过滤2次。
& T6 ?! {7 ^& p) U8 J' J6. 过滤后的悬液1500 rpm离心3min，弃去上清，用3 ml 40%的percoll 重悬待用。
, O9 w$ i0 I/ ]; l1 R% y7. 取一个15ml的离心管，用1 ml的牛血清湿润试管壁，除去多余血清，再加入6m 70%的percoll。
1 V* q" \% c) y2 i3 n& G) Q. \8. 用巴斯德管吸取6中的细胞悬液，试管稍倾，在距离液面1cm处紧贴管壁任其自然慢慢流下，注意勿破坏分离层的界面。
! [1 X3 R$ c, n, i* t9.再吸取1 ml的洗液铺于40% 的percoll上层。
- m) z- n; }0 Q+ Q& J) I! E10.将离心机的加速度调为0，在水平离心机上800g（我们的为2000rpm）室温（20度）离心20min。/ t- u; @# @8 w
11.吸取40% percoll和70%percoll之间的细胞，加入5ml洗液，离心去上清。& {7 Q8 D6 n5 L& r) W* e
12. 向细胞沉淀中加入3ml的红细胞裂解液，转移至6 cm皿中，冰盒上孵育4min，再加入6ml洗液稀释裂解液，1500 rpm 4度 离心3min，弃上清。+ Q( z# J; L- B4 m9 u9 m- s. K+ {
13. 用洗液洗涤2遍后，培养液重悬待用。& @/ N3 C4 j( U6 R0 E7 u8 x' y
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thor0504

回复 momoenn 的帖子, F/ g5 P- A! _3 W! z; j& v1 H
. R" s6 o3 v) d8 ]/ V
取血量是多少？按照什么程序操作的？用的什么方法分离的？密度梯度还是别的？

momoenn

回复 Andyhigh 的帖子! {9 B6 c% u9 r

- |4 D+ ?, Q8 l我们用的是ficoll

momoenn

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; A% V, C9 v1 J4 k; Q5 U
& x5 \% \% C+ n, [100ml，沉降加密度梯度离心

thor0504

回复 momoenn 的帖子# x, |& K' t/ n' F( I% \( V

, }& E6 ~3 ]' G7 f' a0 V具体的步骤呢？每步的离心力、时间、ficoll的用量分别是多少？有先分离血浆吗？

heirrii

100ml外周血，应该能分很多啊

heirrii

血液先稀释没

levell

血液细胞用PBS稀释后加入到淋巴细胞分离液上，离心，注意离心加速度调到最低，很关键，不然起步和停止速度过快就会把液面打散了' l4 p4 u  \- u. ?- X$ _2 t

weijunning

回复 momoenn 的帖子& m( K: `# @6 P* P
3 {% g+ g) b( \% A+ U
请问这个病人是什么病人？如果是癌症患者，无动员直接从上肢静脉抽血，很难获得足够数量的PBMC，有的血象差的病人基本上分离不到白膜层。所以，建议还是先动员一下再采血比较好。