western 疑问

huangcong1988

最近做western，蛋白分子量大小为，40_55kda,我电泳时间为120min，100V，转膜为100mA，100min，一抗跟二抗稀释均为1：:2000（稀释比例都不算高），结果照胶完全没带，连内参也没有带，这是为什么呢？求大神指点，谢谢了先！

ciweiyuan

你干转还是湿转？! `* X9 }/ I% O+ ?( f9 H, K. _% V

青云之上

1 K& ?  y2 Y! }+ V
; [' O2 t' l/ U1 M转移效率如何？建议：" y1 d) U; l" x. u
1、跑完电泳可以用考马染胶看看你提的蛋白没有问题；
) M" N, e8 Y6 S  F$ h' [. C( D* \2、转完摸后 用立春红染色 看下蛋白是否从胶上成功转到摸上了；3 z+ T5 S( v4 ~$ r. W  C0 V& v
3、摸一下一抗 二抗的浓度， 即从大浓度开始做，尽管会出现非特异性条带，% S) p* X9 D5 X% B6 b
      最起码条带出来了，然后再已不同的抗体稀释比做，背景深了 可以加大/ `( r$ X1 F/ f2 `* P+ k: L2 |- {
      封闭液的浓度和时间。

huangcong1988

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8 \) F- \6 A' Q- ?, h7 t  U/ e) Z6 g% X: ~/ D+ E+ ?3 G, M
湿转

huangcong1988

回复 青云之上 的帖子' W, s5 X8 G' a- ?) C7 s

9 Y/ {1 Z! ^( p6 n2 o( m/ Z8 G跑完电泳怎么看提的蛋白没问题？考染之后胶还能转膜？考染后怎么看能看出蛋白样品没有降解呢？

huangcong1988

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) W% d( l( G; t; M
) s& z/ h  a' G% p  a# M. m还有，我转膜以后marker都转上了，就不知道条带是不是也一样转上了

ccwei0615

If you would like to confirm the efficiency of transfer, you could stain the gel with commassive blue to make sure most of proteins are transferred.

ccwei0615

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) P, n# a* m$ U- h
# `" b$ F7 C. o* u& x7 O  ?Once your protein gel is stained with commassie blue, it won't work again in your following immunoblotting. If your can't see clear individual protein bands in stead of a huge smear, that means your proteins are degraded.

maiweiqian

转膜没转好？抗体有问题？

sc-cxw

湿转可以恒流也可以恒压，我们通常是一张膜60-80mA，两种膜120-160mA.时间为50-60min。你转100min会不会有点过呀？