western 检测的蛋白表达量太少怎么办

hyde

要用抗体检测细胞上的蛋白，做了流式，虽然处理组和对照组的表达量在流式上可以看出差别，但是做western表达量还是太低，没看到条带（是细胞表面的膜蛋白），？有没有什么方法富集呢？除了western 做免疫组化可以替代吗？

qingxingruyu

做WB看表达差异，尤其是都表达量低的话太难做了，免疫组化有看到这样做的，但感觉说服力不如WB

懵懂干细胞

膜蛋白的话可以做免疫荧光试试，如果在WB方法富集的话，可以考虑以下几方面：1、millipore的过滤柱，但是效果不稳定； 2、增加上样量； 3、使用信号增强试剂盒 ； 4、优化其它条件！！！+ e' |9 u7 S5 R1 A% c
祝顺利！

moluxingke

干细胞的建议很好，你如果要定量的话，还是要用WB，免疫组化主要是用来定位的，不过你可以用来试试看是否有表达。另外你收集蛋白的时候，可以专门收集膜蛋白，这样使你的目的蛋白相对量就高一些了，推荐你显影的时候使用超敏显色底物。

食毕莫饥

唉，细胞的话最好还是增加样本量吧

yinchong42

不知道你指的没条带是条带位置不对还是目标位置上拖带还是白板？6 t5 }+ w- w% e& |: l% y4 z. S) m
膜蛋白确实不太好跑，所以你们是用什么裂解液提的蛋白？看看有没有超量表达该蛋白的细胞，试试，如果没有的话就提取相应的组织蛋白试试（当然如果有纯蛋白就更好了）；
2 H8 J9 x$ `, h! T5 _1 P9 q) l0 `还有就是不知你们的wb检测体系是ccd直接检测还是ecl，如果是后者的话可以试试超敏发光底物，不过个人用不惯
/ ]& R& ?- n& {+ ]# F1 ]# |- [还有就是把封闭剂换成BSA再试试，

yuanyecat

如果你熟悉流式原理，明白流式只能看到检测部分的情况不能说明你的所有样品细胞的情况，可能只有10%很强，其他很弱，
( A4 D8 G3 u8 r3 U我的建议是：
! c! b3 G" E: m; W! D% D/ K1.首先看看抗体的特异性是不是很高，你有阳性对照吗？
4 I( \" X, P7 u- \! q# {* G2.再者，如果不是特意性问题，可以用专业的试剂盒浓缩蛋白看看。* \+ H# O% M$ O, b$ m
3.还有最后显色的时候，可以用超强显色的试剂盒，如超敏型辣根过氧化氢酶DAB 显色试剂盒

ceshishua

一般来说western 时，总蛋白的浓度控制在1~3mg/ml，这个可以用标准蛋白加酶标仪来测。
9 i3 U+ y8 H1 `& n  Z1~3mg/ml的体积是长期摸索的结果，大部分时候都是没问题的，除了少数表达量很少的目的蛋白，比如受体蛋白。另外这个浓度范围也可以保证胶孔中的样品加的不至于太满。
0 i% _& r2 d0 E- z/ _. f" A6 ?; J如果只是定性的看，也建议这样摸索一下蛋白浓度。这样一来，根据目的蛋白的表达情况去确定上样量、控制上样体积等方面都会方便一些。

hyde

谢谢，我先试试增加浓度看看
6 ^( X8 \0 I9 }

yinchong42

回复 yuanyecat 的帖子# O, W6 x& H+ _# d

/ g5 n* Z# }2 P- N很多人都说用超敏，但是个人使用超敏的背景太深，不知你们是用的CCD还是胶片直接显色？