小鼠iPS诱导靶细胞形态变化图，大家帮忙分析下是否正常

宋红卫song

病毒侵染2d后：  b9 W' r3 e, i5 I/ g! q

9 @5 c% t' M  F5 F2 K- @相应的pMX-GFP对照：
) [! g9 {  _& }6 y& I  x& t5 v' T: `
) c, N; n/ d, W0 u% H( h病毒侵染3d后：
4 R: Q; i! R+ ~" T: [" ^
# ]/ w) @, ^0 b/ r6 K到病毒侵染4d时，将靶细胞接种到饲养层上。- S! Q9 C# V0 o5 T( z
第9天细胞形态：' `7 I" g5 `) t  M- C
! n: A. q1 ?/ d/ E- X8 d1 \

/ _: j  v' f+ K1 G  |  a0 a' i6 M正常来讲，四因子诱导第9天，应该出现mES样克隆。然而我发现克隆并非长得像典型的ES样，而是呈现不规则形、不够致密、细胞核清晰可见、边缘不清晰等。# {0 D; R* R  I" K2 f
我用的是Oct4-EGFP鼠，第九天没看到绿色荧光。. P' V! U' f) H4 o. e# ]" D$ C
分析后，发现可能有以下原因：
  A' P4 S2 X" ?! G1 T# [, m1、病毒量还不够，细胞诱导不充分，发生不完全重编程，类似克隆形状只是因为这些细胞分裂旺盛；' c( u" Z' ^; e5 i: R
2、LIF失效。我用的LIF在4°C存放近一年，而有些克隆在边缘才出现核质比高、折射光强的细胞，可能因为LIF失效导致；0 L, m# F, [/ h/ c' L5 p  P
3、本身小鼠四因子诱导在第九天时并不能观察到典型的ES样克隆，我观察的是正常现象，只需继续培养即可。
% k: ~- G" u3 T" d  r4 b/ e4、其他原因。
# u: c; C- ?  O) Q4 N* l4 ^/ t1 P! O希望有相关经验的科研工作者为我解答一二，我观察的克隆形态是否正常，如果不正常，其可能的原因是什么？
4 S  `! A, p1 |6 i6 R8 u1 O- ~( d3 Z6 J! b2 V
补充内容 (2015-2-6 16:45):
) f- P9 u: Y% n. w; C, T+ a发帖时有些小错误：最后三张图中，前两张是pMX-GFP对照。最后一张是OSKM+miR-200c+miR-302诱导iPS

scottist

回复 宋红卫song 的帖子
; X  P2 q2 c* x* \
% _; l/ w7 I) q6 d% x) u3 x从形态来看，你9天诱导后的克隆是非正常的，正常情况的话，9天的克隆应该是很漂亮的圆形克隆，细胞紧密排列，遮光性强，像一个金色的圆盘，周围还可能围绕一圈分化的细胞。个人猜测是你的慢病毒感染效率较低造成的不完全重编程。请确保慢病毒的滴度和活性后，再使用。

saifast00

我觉得9d时候克隆还可以挽救，再过两天看能不能变得致密一些？

sylar.wy

感觉抢救不了。。。第四天细胞才这么少？4因子细胞很多的
3 ]3 D$ Q& ?/ c1 e4 u小鼠做ips中途不用传到FEEDER也行吧
4 A. \8 @4 z. `8 h9 \
2 V1 S' o- n6 {7 c3 i; A) X6 _: f* j补充内容 (2015-2-10 14:05):; h  m. _7 S3 M+ W( g
第九天- -

宋红卫song

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5 d' Y8 S/ I$ o9 L( n: C, `) W7 ?3 C7 P) ^
嗯，感谢您的建议！

宋红卫song

回复 saifast00 的帖子
" K2 d  j# @- y$ O: ^8 ~4 ?# K& w) g' d/ H: n+ ], c7 }% O1 k
嗯，目前正在观察。后来发现细胞间隙和细胞上附着很多黑点，有的地方还很密集，怀疑是支原体。不知您是否也遇到过类似的情况？

宋红卫song

回复 sylar.wy 的帖子" v6 Q% ?' E% f" L# ^# ]
$ ~7 Z! w4 c- Q
嗯，也有不转导feeder上的。下次分出一皿尝试一下

saifast00

回复 宋红卫song 的帖子
; B% D/ H% u, S
. U, [3 k' M0 }5 ^* B$ p5 p支原体如果不是非常严重理论上肉眼是不可见的，而且如果你们实验室不是常做原代培养，污染支原体的几率也不大

cloudycity

直接不用feeder也可以吧。你的估计是病毒滴度不够，效率不够高。

琴心杜若

本人新手，前辈进展如何？跪求指教