造血干细胞流式检测结果分析

SKC-SFC

各位大侠，我们实验室目前在做造血干细胞的鉴定。采用流式细胞仪检测，选择的标志物是CD34+CD45+CD133./ A3 b  @3 f8 k+ j2 i% w3 X- N
方法是：标记去红后，用CD45/SSC画R1门，圈定白细胞-画CD34/SSC双参数图，显示R1门，画R2,-建立CD45/SSC双参数图，显示R2门，画R3门-建立FSC/SSC散点图，显示R3画R4门-回到R1门所在图，选择CD45阳性最强和SSC最大的位置画R5门-重新确立R4门的位置-画CD34/CD45&CD45+CD133双参数的十字门，确定R1门的临界位置来重新确定R3的位置。
. d" e5 D4 q# S7 Q2 r- D8 v% @) r+ x- [不明白的地方：% ~4 c, g- T5 Q5 C3 y4 t9 a& d. b
1.CD133的必要性
) G: Z3 D7 K' G2 Z! c" k) V2.最终造血干细胞的统计学数据是R3还是R4的统计学数据？5 t0 X( u2 ]# M+ L: H! U2 E
3.通过R5门来重新确定R4门作用在哪里？$ ?8 Z# d  |% A4 S6 o0 }! }0 v9 S# `
4.我的这个实验思路无问题- d0 N1 g6 \; C+ e6 r1 \
求各位大侠指点，谢谢！) w5 i: e; V# W* x0 g1 e
   

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顶起

nailute1985

1、cd133必要性不是很强，造血干的特异性标记就是cd34+ 所以用双标就可以了。
+ u$ C* M) J2 b; B% v" `2、你用的是十字门吧？但是我们做造血干的标记的话是用的逻辑门，大体上是这样的：首先ssc／cd45设门圈有核R1，然后R1里面做cd34+／ssc 圈cd34强阳为R2，然后R2里面做cd45/ssc 圈弱阳cd45为r3，然后r3里面做fsc／ssc 圈弱ssc那部分为r4，r4就是结果。# k0 u7 m+ e- O
3、楼主选的是强阳性的cd45吗？我觉得应该在cd34＋细胞群中找到弱cd45的 那才是真正的造血干，并且在ssc／fsc中也要找出ssc弱的那部分。

SKC-SFC

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首先要谢谢您的回复。# }* p0 v/ ]! N* r6 ^- \8 N5 ]
1.选择CD133是老板的意思，因为国外不少文献说，CD34-的那部分细胞也具有造血功能，而且不少国外文献有把CD133加入和协助鉴定造血干细胞。' Y2 l) x- m% G9 f* m3 p
2.我们这边也是把CD34+中找CD45弱阳性的那群。/ O* o5 M+ y7 ^7 J3 d8 R  W
3.您说您觉得R4就是结果，我一直觉得R3是结果。因为R4不是为了验证这群细胞是否落在幼稚的淋巴群中，只是为了验证？0 E. W, G4 \1 c. L; J
4.建立FSC/SSC双参数图的真正意义在哪里？2 `5 ?1 O" Z  O! ?3 ?3 ^
5.设立十字门的目的又对整个结果起啥作用。从实验设计来看，设立CD34+CD45的双参数十字门是为调整R3的位置来设置的哦。2 K4 u! S* W# l% [: I& w+ B1 N
6.关于R5门的画定，有时候左边的杂细胞群挺多，R5的位置不是那么好花，很担心是把单核细胞群画进去了。

nailute1985

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1、你们是研究，我们是临床，所以肯定成本我们会考虑进去，cd133成本会高很多。其实绝大部分的造血干都会表达cd34，剩下的只是极小一部分
) y, O2 T. e/ j$ \1 L( ^! p3、R3可以基本确定，R4的用意确实是为了验证这群细胞是否在淋巴群里，但是我觉得r4是很有必要的，因为如果你看r4的流式图的话，会发现r4的范围很宽，所以最后圈r4还是有必要的。不能全圈上，不太准。6 i. [0 G2 K* Z* C# g! ^
4、fsc／ssc这个是必须的，无论做哪个标记。这个就是最直观的看三系分区的状态的。
! W9 c2 Q8 x& L+ M6 f5、其实十字门也不是不可以，但是对于逻辑门来说更合适，十字门分区并不是很准确，会有压线那种情况，不好区分。& L  K/ E+ q; R+ U5 Q- {3 M
6、这个是比较常见的状态，因为这跟你去红去的干净不干净，或者血液本身的质量有很大关系。

SKC-SFC

回复 nailute1985 的帖子& J! Y* p% j7 f2 B. ?

1 V) {) ^7 c) G1 F- N1.我们也是临床，只是老板希望我们先累计CD133的数据，通过将CD34+和CD133+的数据进行统计学的分析，若无差异的话，就可以采取CD34+CD45直接进行标记检测并分析。
4 I! }6 Y/ n) S, g# Y2.从您表达的意思来看，造血干细胞应该具备以下几个条件：CD34+，CD45弱阳性，这群细胞是位于幼稚淋巴细胞群里？* p- i5 }0 z- K. K$ @0 E
3.我们画R4门，就是在FSC/SSC的散点图中画的。! f4 ]- n8 a) U4 S, O& f
4.关于十字门我赞同您的意见。但文献都这么做，不知道是为什么？- H' x& S: M3 H* u& K1 p
5.我们去红还算是非常的干净，有时候做出的我图和文献上一致，结果也好分析，有时候回有左侧拖尾的情况，我们一般是通过调大阈值来去除干扰。因为我们的设备不需要调电压。
" F: n( P8 `! ?# j5 ~6.最后咨询一下CD34+CD45+CD133做同型对照的实验设计.) G' H6 R$ z5 S8 y7 h1 |4 Y
谢谢！

nailute1985

2、并不是cd34+和cd45弱阳，而是cd34+与cd45+的那一群圈出来之后，相对再找出cd45弱阳的那些。对，位于幼淋那片) P+ c9 W( Z  [! B9 N3 v) B: x
4、十字门在文献中很直观，直接就能看出来双阳或其他的，不像逻辑门，还得一步步分析，文献中是没办法解释的。. F: J2 P3 T! D+ b
6、isotype的话，很简单，不就是要去除非特异性的么，所以只要把cd34和cd133换成同性对照就ok了。cd45依然做阳性管
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fm100200

学习了

SKC-SFC

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  ?5 a7 P8 N! B$ W5 r- E+ N
' l+ F) ~4 u+ J- K, m# u谢谢.

yuanyecat

上图啊没图没真相啊