造血干细胞流式检测结果分析

SKC-SFC

各位大侠，我们实验室目前在做造血干细胞的鉴定。采用流式细胞仪检测，选择的标志物是CD34+CD45+CD133.3 N- Y+ u& O! t; D1 q9 L- F
方法是：标记去红后，用CD45/SSC画R1门，圈定白细胞-画CD34/SSC双参数图，显示R1门，画R2,-建立CD45/SSC双参数图，显示R2门，画R3门-建立FSC/SSC散点图，显示R3画R4门-回到R1门所在图，选择CD45阳性最强和SSC最大的位置画R5门-重新确立R4门的位置-画CD34/CD45&CD45+CD133双参数的十字门，确定R1门的临界位置来重新确定R3的位置。
6 y# [! x' }2 V- I* l% t3 U/ C/ n- l不明白的地方：
  y3 f; m2 J" p) C7 N; f2 G7 }1.CD133的必要性
" N6 k3 B" _/ n0 B2.最终造血干细胞的统计学数据是R3还是R4的统计学数据？6 v% q7 J8 {- T" J2 K
3.通过R5门来重新确定R4门作用在哪里？
5 D' P; u6 }# b4.我的这个实验思路无问题
6 y0 B: h( E' Z8 N4 _求各位大侠指点，谢谢！9 }4 \8 T' c, O5 e6 b8 F  R! n
   

SKC-SFC

顶起

nailute1985

1、cd133必要性不是很强，造血干的特异性标记就是cd34+ 所以用双标就可以了。, w" c: \: {. U, e
2、你用的是十字门吧？但是我们做造血干的标记的话是用的逻辑门，大体上是这样的：首先ssc／cd45设门圈有核R1，然后R1里面做cd34+／ssc 圈cd34强阳为R2，然后R2里面做cd45/ssc 圈弱阳cd45为r3，然后r3里面做fsc／ssc 圈弱ssc那部分为r4，r4就是结果。
, x. P. [: R6 f% e9 ?" I' v3、楼主选的是强阳性的cd45吗？我觉得应该在cd34＋细胞群中找到弱cd45的 那才是真正的造血干，并且在ssc／fsc中也要找出ssc弱的那部分。

SKC-SFC

回复 nailute1985 的帖子. u& x/ u7 M! @8 U, `
5 N1 r$ M/ S+ \* p
首先要谢谢您的回复。7 v% {# R2 i8 x
1.选择CD133是老板的意思，因为国外不少文献说，CD34-的那部分细胞也具有造血功能，而且不少国外文献有把CD133加入和协助鉴定造血干细胞。' a. O1 n3 m# ]0 n- ]
2.我们这边也是把CD34+中找CD45弱阳性的那群。6 k' O% j+ C; B! a
3.您说您觉得R4就是结果，我一直觉得R3是结果。因为R4不是为了验证这群细胞是否落在幼稚的淋巴群中，只是为了验证？' N2 t! B  W( t3 {/ n
4.建立FSC/SSC双参数图的真正意义在哪里？4 k# D8 z; s6 R. S
5.设立十字门的目的又对整个结果起啥作用。从实验设计来看，设立CD34+CD45的双参数十字门是为调整R3的位置来设置的哦。
2 E* {5 H# u' X$ y* @7 o6.关于R5门的画定，有时候左边的杂细胞群挺多，R5的位置不是那么好花，很担心是把单核细胞群画进去了。

nailute1985

回复 SKC-SFC 的帖子  e9 P+ K) f' i9 I! [

# ^' {  u6 @3 p, g( Z' l) U1、你们是研究，我们是临床，所以肯定成本我们会考虑进去，cd133成本会高很多。其实绝大部分的造血干都会表达cd34，剩下的只是极小一部分
0 q' L6 O' _' O1 [0 b/ ~3、R3可以基本确定，R4的用意确实是为了验证这群细胞是否在淋巴群里，但是我觉得r4是很有必要的，因为如果你看r4的流式图的话，会发现r4的范围很宽，所以最后圈r4还是有必要的。不能全圈上，不太准。
3 V; j& ]2 V3 p4 p5 j4、fsc／ssc这个是必须的，无论做哪个标记。这个就是最直观的看三系分区的状态的。7 {6 R$ P; I) E: O8 @
5、其实十字门也不是不可以，但是对于逻辑门来说更合适，十字门分区并不是很准确，会有压线那种情况，不好区分。
& a& d8 a! Z. [! E6、这个是比较常见的状态，因为这跟你去红去的干净不干净，或者血液本身的质量有很大关系。

SKC-SFC

回复 nailute1985 的帖子
  m  J0 V* K5 b; P8 l7 o
  |% z: W3 g* N5 `) G( C; N  w1.我们也是临床，只是老板希望我们先累计CD133的数据，通过将CD34+和CD133+的数据进行统计学的分析，若无差异的话，就可以采取CD34+CD45直接进行标记检测并分析。
+ Y9 j, R4 M+ m  z9 b# ?' K7 `2.从您表达的意思来看，造血干细胞应该具备以下几个条件：CD34+，CD45弱阳性，这群细胞是位于幼稚淋巴细胞群里？
, F: \, V2 t, Q: _* |3.我们画R4门，就是在FSC/SSC的散点图中画的。* }$ B7 B5 B' f* F. \- F, z4 }
4.关于十字门我赞同您的意见。但文献都这么做，不知道是为什么？0 U$ C# q$ t8 o* b# t5 n' }
5.我们去红还算是非常的干净，有时候做出的我图和文献上一致，结果也好分析，有时候回有左侧拖尾的情况，我们一般是通过调大阈值来去除干扰。因为我们的设备不需要调电压。
2 z7 _3 @3 i9 u( @2 N8 C, K. g6.最后咨询一下CD34+CD45+CD133做同型对照的实验设计.
. S" v6 M; A2 q/ n* P谢谢！

nailute1985

2、并不是cd34+和cd45弱阳，而是cd34+与cd45+的那一群圈出来之后，相对再找出cd45弱阳的那些。对，位于幼淋那片( S5 B* k8 k9 }% F3 v+ o
4、十字门在文献中很直观，直接就能看出来双阳或其他的，不像逻辑门，还得一步步分析，文献中是没办法解释的。5 J5 s( a6 x! O4 M
6、isotype的话，很简单，不就是要去除非特异性的么，所以只要把cd34和cd133换成同性对照就ok了。cd45依然做阳性管
2 G4 m+ w- h. ?) o) R  _

fm100200

学习了

SKC-SFC

回复 nailute1985 的帖子
. s5 i, I* @4 [# E# |7 {/ N4 G) V: [9 [" I
谢谢.

yuanyecat

上图啊没图没真相啊