造血干细胞流式检测结果分析

SKC-SFC

各位大侠，我们实验室目前在做造血干细胞的鉴定。采用流式细胞仪检测，选择的标志物是CD34+CD45+CD133.5 \, k- b1 r7 x8 t$ z( c
方法是：标记去红后，用CD45/SSC画R1门，圈定白细胞-画CD34/SSC双参数图，显示R1门，画R2,-建立CD45/SSC双参数图，显示R2门，画R3门-建立FSC/SSC散点图，显示R3画R4门-回到R1门所在图，选择CD45阳性最强和SSC最大的位置画R5门-重新确立R4门的位置-画CD34/CD45&CD45+CD133双参数的十字门，确定R1门的临界位置来重新确定R3的位置。
+ f) |+ o9 i( ]6 X2 l5 {不明白的地方：
* B, T' [4 a8 ~1.CD133的必要性, o; E1 C) k( H) _  f
2.最终造血干细胞的统计学数据是R3还是R4的统计学数据？
' Q. J( ]& r" i! z! x6 \3 g3.通过R5门来重新确定R4门作用在哪里？
. p+ v8 s* E8 h% Z& U% w# i, ~4.我的这个实验思路无问题- ?; \% P( V  H" e
求各位大侠指点，谢谢！# P+ B! ~) M5 m$ Q
   

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顶起

nailute1985

1、cd133必要性不是很强，造血干的特异性标记就是cd34+ 所以用双标就可以了。! {# v& n3 |/ `- I- ^  t- S* O- W# }
2、你用的是十字门吧？但是我们做造血干的标记的话是用的逻辑门，大体上是这样的：首先ssc／cd45设门圈有核R1，然后R1里面做cd34+／ssc 圈cd34强阳为R2，然后R2里面做cd45/ssc 圈弱阳cd45为r3，然后r3里面做fsc／ssc 圈弱ssc那部分为r4，r4就是结果。
# _* n8 q2 J/ i3、楼主选的是强阳性的cd45吗？我觉得应该在cd34＋细胞群中找到弱cd45的 那才是真正的造血干，并且在ssc／fsc中也要找出ssc弱的那部分。

SKC-SFC

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0 l& W( \4 Y  M: \
. w" Y0 ~, z) M首先要谢谢您的回复。4 o0 o9 ]1 ]0 }# @6 b3 w( [
1.选择CD133是老板的意思，因为国外不少文献说，CD34-的那部分细胞也具有造血功能，而且不少国外文献有把CD133加入和协助鉴定造血干细胞。
0 c1 C; _5 U+ {! K2 r7 f7 L2.我们这边也是把CD34+中找CD45弱阳性的那群。
0 V; d" N6 j7 Q3 Q3.您说您觉得R4就是结果，我一直觉得R3是结果。因为R4不是为了验证这群细胞是否落在幼稚的淋巴群中，只是为了验证？
1 ^4 d# T7 T; t( _/ A) [4.建立FSC/SSC双参数图的真正意义在哪里？# {/ K1 F% d6 }  T3 B
5.设立十字门的目的又对整个结果起啥作用。从实验设计来看，设立CD34+CD45的双参数十字门是为调整R3的位置来设置的哦。
/ _3 t* o3 Z* c6.关于R5门的画定，有时候左边的杂细胞群挺多，R5的位置不是那么好花，很担心是把单核细胞群画进去了。

nailute1985

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  O) p5 H! D5 a
& z/ z- r" J+ ?1、你们是研究，我们是临床，所以肯定成本我们会考虑进去，cd133成本会高很多。其实绝大部分的造血干都会表达cd34，剩下的只是极小一部分
+ u, b; ]- R! T2 S1 W3、R3可以基本确定，R4的用意确实是为了验证这群细胞是否在淋巴群里，但是我觉得r4是很有必要的，因为如果你看r4的流式图的话，会发现r4的范围很宽，所以最后圈r4还是有必要的。不能全圈上，不太准。
6 e' w' [9 d/ y6 V1 S/ G# f( c& h6 g4、fsc／ssc这个是必须的，无论做哪个标记。这个就是最直观的看三系分区的状态的。. ~2 ]3 \' H/ d: z
5、其实十字门也不是不可以，但是对于逻辑门来说更合适，十字门分区并不是很准确，会有压线那种情况，不好区分。
6 |4 G* U3 m: c# y' y6、这个是比较常见的状态，因为这跟你去红去的干净不干净，或者血液本身的质量有很大关系。

SKC-SFC

回复 nailute1985 的帖子, q. q! W1 d" ~$ P
- f. v- }; }9 s. e
1.我们也是临床，只是老板希望我们先累计CD133的数据，通过将CD34+和CD133+的数据进行统计学的分析，若无差异的话，就可以采取CD34+CD45直接进行标记检测并分析。" y3 y- T- Y- t4 K: b  p& @
2.从您表达的意思来看，造血干细胞应该具备以下几个条件：CD34+，CD45弱阳性，这群细胞是位于幼稚淋巴细胞群里？
/ A! h: [% U) d; ^( W: w# c3.我们画R4门，就是在FSC/SSC的散点图中画的。3 ~4 |2 G$ x% D" n! v( G5 @
4.关于十字门我赞同您的意见。但文献都这么做，不知道是为什么？
+ q+ ~& o: c# ~' K, O5.我们去红还算是非常的干净，有时候做出的我图和文献上一致，结果也好分析，有时候回有左侧拖尾的情况，我们一般是通过调大阈值来去除干扰。因为我们的设备不需要调电压。
" }! }- J6 J: K% l6.最后咨询一下CD34+CD45+CD133做同型对照的实验设计.
4 p& K' a  [; n& f* E" w! J; W谢谢！

nailute1985

2、并不是cd34+和cd45弱阳，而是cd34+与cd45+的那一群圈出来之后，相对再找出cd45弱阳的那些。对，位于幼淋那片
8 B* w* R; Z" m' W4、十字门在文献中很直观，直接就能看出来双阳或其他的，不像逻辑门，还得一步步分析，文献中是没办法解释的。
# W4 C) y) D* q5 y, v+ Z6、isotype的话，很简单，不就是要去除非特异性的么，所以只要把cd34和cd133换成同性对照就ok了。cd45依然做阳性管  h% k' I) X& W. T' s7 D* ?

fm100200

学习了

SKC-SFC

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: I6 M, e8 @0 _7 v- O, @谢谢.

yuanyecat

上图啊没图没真相啊