造血干细胞流式检测结果分析

SKC-SFC

各位大侠，我们实验室目前在做造血干细胞的鉴定。采用流式细胞仪检测，选择的标志物是CD34+CD45+CD133.2 a! p2 U' O4 U9 B' [
方法是：标记去红后，用CD45/SSC画R1门，圈定白细胞-画CD34/SSC双参数图，显示R1门，画R2,-建立CD45/SSC双参数图，显示R2门，画R3门-建立FSC/SSC散点图，显示R3画R4门-回到R1门所在图，选择CD45阳性最强和SSC最大的位置画R5门-重新确立R4门的位置-画CD34/CD45&CD45+CD133双参数的十字门，确定R1门的临界位置来重新确定R3的位置。
( r6 i$ @0 C! j8 h6 i: T% I6 f不明白的地方：  @+ A# P. D( W" W: L$ |% n" p
1.CD133的必要性6 U( v' ?7 b# |6 X! o
2.最终造血干细胞的统计学数据是R3还是R4的统计学数据？
) ]! M- d4 ^  T) ~/ I( C3 m3.通过R5门来重新确定R4门作用在哪里？. U! g% f' u3 ~! ^9 w, i! U' c
4.我的这个实验思路无问题) ^2 J1 M2 g. Y+ t0 p  H( p  J: C
求各位大侠指点，谢谢！" x& }7 p0 c: b0 I
   

SKC-SFC

顶起

nailute1985

1、cd133必要性不是很强，造血干的特异性标记就是cd34+ 所以用双标就可以了。
, B: j/ I1 ]  M3 r2 g( s2、你用的是十字门吧？但是我们做造血干的标记的话是用的逻辑门，大体上是这样的：首先ssc／cd45设门圈有核R1，然后R1里面做cd34+／ssc 圈cd34强阳为R2，然后R2里面做cd45/ssc 圈弱阳cd45为r3，然后r3里面做fsc／ssc 圈弱ssc那部分为r4，r4就是结果。
1 }# y5 z- C9 y  G/ E" G; X3、楼主选的是强阳性的cd45吗？我觉得应该在cd34＋细胞群中找到弱cd45的 那才是真正的造血干，并且在ssc／fsc中也要找出ssc弱的那部分。

SKC-SFC

回复 nailute1985 的帖子/ Z' ]* q. s( o2 a  N4 E
( U2 X" a3 ]4 a$ q0 E& R6 z
首先要谢谢您的回复。
6 \; s# z% c! v/ D; {1.选择CD133是老板的意思，因为国外不少文献说，CD34-的那部分细胞也具有造血功能，而且不少国外文献有把CD133加入和协助鉴定造血干细胞。- n: K1 }" q( t9 g- I& o) e
2.我们这边也是把CD34+中找CD45弱阳性的那群。
# \( ?9 T( r0 I3.您说您觉得R4就是结果，我一直觉得R3是结果。因为R4不是为了验证这群细胞是否落在幼稚的淋巴群中，只是为了验证？6 ?) m% v3 t9 F8 B( I; q. ^  ^
4.建立FSC/SSC双参数图的真正意义在哪里？( W* X* ^, ~  P
5.设立十字门的目的又对整个结果起啥作用。从实验设计来看，设立CD34+CD45的双参数十字门是为调整R3的位置来设置的哦。
" ~( V# f* }8 s2 k* I$ h9 y6.关于R5门的画定，有时候左边的杂细胞群挺多，R5的位置不是那么好花，很担心是把单核细胞群画进去了。

nailute1985

回复 SKC-SFC 的帖子
5 l1 g% ~  J# H/ p
* ^6 }7 b5 i$ Y" s1、你们是研究，我们是临床，所以肯定成本我们会考虑进去，cd133成本会高很多。其实绝大部分的造血干都会表达cd34，剩下的只是极小一部分/ Q; P* i" K; P3 e1 C) X
3、R3可以基本确定，R4的用意确实是为了验证这群细胞是否在淋巴群里，但是我觉得r4是很有必要的，因为如果你看r4的流式图的话，会发现r4的范围很宽，所以最后圈r4还是有必要的。不能全圈上，不太准。7 Z* u1 ?, n9 R, J' n6 e
4、fsc／ssc这个是必须的，无论做哪个标记。这个就是最直观的看三系分区的状态的。
' B* h6 R9 V# A; k& F) c  v5、其实十字门也不是不可以，但是对于逻辑门来说更合适，十字门分区并不是很准确，会有压线那种情况，不好区分。
" a4 w  ?! g* y" U6 W6、这个是比较常见的状态，因为这跟你去红去的干净不干净，或者血液本身的质量有很大关系。

SKC-SFC

回复 nailute1985 的帖子
# K: {3 w8 R# T( X+ r# b5 o$ J  g
1.我们也是临床，只是老板希望我们先累计CD133的数据，通过将CD34+和CD133+的数据进行统计学的分析，若无差异的话，就可以采取CD34+CD45直接进行标记检测并分析。
4 {$ N! V+ r6 p( Z- q& e' N) d( I; y2.从您表达的意思来看，造血干细胞应该具备以下几个条件：CD34+，CD45弱阳性，这群细胞是位于幼稚淋巴细胞群里？
+ F- b- K6 [9 b0 C6 M/ t4 `3.我们画R4门，就是在FSC/SSC的散点图中画的。
, A8 v" z+ J+ D: K7 E3 b' z4.关于十字门我赞同您的意见。但文献都这么做，不知道是为什么？) n" ]$ D. f, a( w4 ^. x, o
5.我们去红还算是非常的干净，有时候做出的我图和文献上一致，结果也好分析，有时候回有左侧拖尾的情况，我们一般是通过调大阈值来去除干扰。因为我们的设备不需要调电压。
8 @9 G6 @% p; E9 ~* R! `. H6.最后咨询一下CD34+CD45+CD133做同型对照的实验设计.
" j% a% e0 o8 z7 w9 \0 r( O谢谢！

nailute1985

2、并不是cd34+和cd45弱阳，而是cd34+与cd45+的那一群圈出来之后，相对再找出cd45弱阳的那些。对，位于幼淋那片4 V1 u" N6 C4 `9 v7 q8 f$ c: H
4、十字门在文献中很直观，直接就能看出来双阳或其他的，不像逻辑门，还得一步步分析，文献中是没办法解释的。
  u1 q7 J+ B0 ]5 o1 {. H6、isotype的话，很简单，不就是要去除非特异性的么，所以只要把cd34和cd133换成同性对照就ok了。cd45依然做阳性管
$ D& d' t4 R$ a0 \! R

fm100200

学习了

SKC-SFC

回复 nailute1985 的帖子
  q5 H- {4 o. `2 l! I! w( ?& {" y( i* U, C( n" G. b
谢谢.

yuanyecat

上图啊没图没真相啊