造血干细胞流式检测结果分析

SKC-SFC

各位大侠，我们实验室目前在做造血干细胞的鉴定。采用流式细胞仪检测，选择的标志物是CD34+CD45+CD133.
1 J' \2 M9 T. ~方法是：标记去红后，用CD45/SSC画R1门，圈定白细胞-画CD34/SSC双参数图，显示R1门，画R2,-建立CD45/SSC双参数图，显示R2门，画R3门-建立FSC/SSC散点图，显示R3画R4门-回到R1门所在图，选择CD45阳性最强和SSC最大的位置画R5门-重新确立R4门的位置-画CD34/CD45&CD45+CD133双参数的十字门，确定R1门的临界位置来重新确定R3的位置。3 p. j6 \. Z  m* o% E
不明白的地方：
$ M* O$ B8 A3 C* Y- V7 _% t1.CD133的必要性8 I( r$ E. z$ L* F7 A4 U
2.最终造血干细胞的统计学数据是R3还是R4的统计学数据？
. z9 X7 J# P0 s/ a0 M3.通过R5门来重新确定R4门作用在哪里？
; z, }8 [4 ]6 E8 M) `' r8 T4.我的这个实验思路无问题2 @" T' x: c) p  X0 O
求各位大侠指点，谢谢！
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顶起

nailute1985

1、cd133必要性不是很强，造血干的特异性标记就是cd34+ 所以用双标就可以了。
2 l1 G! M. _8 M) D5 V2、你用的是十字门吧？但是我们做造血干的标记的话是用的逻辑门，大体上是这样的：首先ssc／cd45设门圈有核R1，然后R1里面做cd34+／ssc 圈cd34强阳为R2，然后R2里面做cd45/ssc 圈弱阳cd45为r3，然后r3里面做fsc／ssc 圈弱ssc那部分为r4，r4就是结果。  M* @! o/ m- @% I3 u( x0 ]
3、楼主选的是强阳性的cd45吗？我觉得应该在cd34＋细胞群中找到弱cd45的 那才是真正的造血干，并且在ssc／fsc中也要找出ssc弱的那部分。

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( `% }: V% R+ A7 T
! U! @- h1 `, l% q首先要谢谢您的回复。5 _# Q8 f. \6 M6 j; T+ F5 }6 t% M
1.选择CD133是老板的意思，因为国外不少文献说，CD34-的那部分细胞也具有造血功能，而且不少国外文献有把CD133加入和协助鉴定造血干细胞。, T. b: x8 b1 u2 n3 Z
2.我们这边也是把CD34+中找CD45弱阳性的那群。5 s% M6 T- `6 H8 ^* O( t
3.您说您觉得R4就是结果，我一直觉得R3是结果。因为R4不是为了验证这群细胞是否落在幼稚的淋巴群中，只是为了验证？
6 i" P8 R" Q  l; x# [/ C0 ^4.建立FSC/SSC双参数图的真正意义在哪里？
: `; u. ?" C  Y2 t0 D: S2 Y5.设立十字门的目的又对整个结果起啥作用。从实验设计来看，设立CD34+CD45的双参数十字门是为调整R3的位置来设置的哦。3 T1 \' _! N" n8 M+ k6 T6 f3 L; V- k5 h
6.关于R5门的画定，有时候左边的杂细胞群挺多，R5的位置不是那么好花，很担心是把单核细胞群画进去了。

nailute1985

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7 ]0 \  h9 N$ O$ X2 h9 Z( o4 I
1、你们是研究，我们是临床，所以肯定成本我们会考虑进去，cd133成本会高很多。其实绝大部分的造血干都会表达cd34，剩下的只是极小一部分% E5 w6 p6 b. s0 j, W
3、R3可以基本确定，R4的用意确实是为了验证这群细胞是否在淋巴群里，但是我觉得r4是很有必要的，因为如果你看r4的流式图的话，会发现r4的范围很宽，所以最后圈r4还是有必要的。不能全圈上，不太准。) q+ Z" {1 R8 O! s8 w% V/ ]
4、fsc／ssc这个是必须的，无论做哪个标记。这个就是最直观的看三系分区的状态的。
4 `8 T7 v2 q/ O, D4 x3 c+ ?5、其实十字门也不是不可以，但是对于逻辑门来说更合适，十字门分区并不是很准确，会有压线那种情况，不好区分。
) p; S# {* g7 Y" X; H. ^4 U7 A6、这个是比较常见的状态，因为这跟你去红去的干净不干净，或者血液本身的质量有很大关系。

SKC-SFC

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. B% I/ ?  c9 B! D5 C: B4 }4 m4 {. ?% v: A7 @6 c8 Z% S/ V
1.我们也是临床，只是老板希望我们先累计CD133的数据，通过将CD34+和CD133+的数据进行统计学的分析，若无差异的话，就可以采取CD34+CD45直接进行标记检测并分析。
) k; p$ H" S9 _& b2 \& M2.从您表达的意思来看，造血干细胞应该具备以下几个条件：CD34+，CD45弱阳性，这群细胞是位于幼稚淋巴细胞群里？
1 C, j& F; K- S% {0 k9 C0 `3.我们画R4门，就是在FSC/SSC的散点图中画的。
0 A& d# `9 ~9 I0 y3 ]4.关于十字门我赞同您的意见。但文献都这么做，不知道是为什么？
% `1 e1 U6 `% N4 ~/ ^& R2 I5.我们去红还算是非常的干净，有时候做出的我图和文献上一致，结果也好分析，有时候回有左侧拖尾的情况，我们一般是通过调大阈值来去除干扰。因为我们的设备不需要调电压。; Q6 X. V! v1 Y( f$ Y
6.最后咨询一下CD34+CD45+CD133做同型对照的实验设计.# R+ u+ X) u0 I8 m# b
谢谢！

nailute1985

2、并不是cd34+和cd45弱阳，而是cd34+与cd45+的那一群圈出来之后，相对再找出cd45弱阳的那些。对，位于幼淋那片* n( O! v' z- F8 ^" V
4、十字门在文献中很直观，直接就能看出来双阳或其他的，不像逻辑门，还得一步步分析，文献中是没办法解释的。9 Q0 B4 E3 n0 P9 ~9 \4 p; V( l1 t
6、isotype的话，很简单，不就是要去除非特异性的么，所以只要把cd34和cd133换成同性对照就ok了。cd45依然做阳性管2 X& n$ z- J  y6 a

fm100200

学习了

SKC-SFC

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, a, U6 t& @9 f: V" c; I( s1 ?+ m& y
9 e' L& S" K- ?5 a7 ^谢谢.

yuanyecat

上图啊没图没真相啊