造血干细胞流式检测结果分析

SKC-SFC

各位大侠，我们实验室目前在做造血干细胞的鉴定。采用流式细胞仪检测，选择的标志物是CD34+CD45+CD133.
/ D3 t. A; s, b. s$ E9 N& r方法是：标记去红后，用CD45/SSC画R1门，圈定白细胞-画CD34/SSC双参数图，显示R1门，画R2,-建立CD45/SSC双参数图，显示R2门，画R3门-建立FSC/SSC散点图，显示R3画R4门-回到R1门所在图，选择CD45阳性最强和SSC最大的位置画R5门-重新确立R4门的位置-画CD34/CD45&CD45+CD133双参数的十字门，确定R1门的临界位置来重新确定R3的位置。# N' d. @* V2 _" I, |2 O
不明白的地方：
5 W  P' C2 X3 h+ d, s1.CD133的必要性
& l- d3 H, w) g, M' b& `2.最终造血干细胞的统计学数据是R3还是R4的统计学数据？
  m; l& `) ]1 l: }2 L% A. S7 _3.通过R5门来重新确定R4门作用在哪里？4 c- k# m) J6 V7 D. V
4.我的这个实验思路无问题
( o$ J( Y* J5 C求各位大侠指点，谢谢！
& M: y4 t; x# Q: A1 s% w   

SKC-SFC

顶起

nailute1985

1、cd133必要性不是很强，造血干的特异性标记就是cd34+ 所以用双标就可以了。: R( y7 m6 }5 x& b+ K
2、你用的是十字门吧？但是我们做造血干的标记的话是用的逻辑门，大体上是这样的：首先ssc／cd45设门圈有核R1，然后R1里面做cd34+／ssc 圈cd34强阳为R2，然后R2里面做cd45/ssc 圈弱阳cd45为r3，然后r3里面做fsc／ssc 圈弱ssc那部分为r4，r4就是结果。$ t( [9 P7 q1 \( s* Q3 N
3、楼主选的是强阳性的cd45吗？我觉得应该在cd34＋细胞群中找到弱cd45的 那才是真正的造血干，并且在ssc／fsc中也要找出ssc弱的那部分。

SKC-SFC

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7 T& K" ?, [7 L4 R
: j( B1 G2 B, j& V$ i" C: `首先要谢谢您的回复。- M2 t8 N" U: h( [
1.选择CD133是老板的意思，因为国外不少文献说，CD34-的那部分细胞也具有造血功能，而且不少国外文献有把CD133加入和协助鉴定造血干细胞。0 p% U* N/ `! m
2.我们这边也是把CD34+中找CD45弱阳性的那群。
( K& O' r' }, P* |! e+ _' R0 `* Q3.您说您觉得R4就是结果，我一直觉得R3是结果。因为R4不是为了验证这群细胞是否落在幼稚的淋巴群中，只是为了验证？
+ X3 _" V& |. H% F- x- p  Y4.建立FSC/SSC双参数图的真正意义在哪里？0 k* X2 x3 b2 x0 `5 d9 @+ {
5.设立十字门的目的又对整个结果起啥作用。从实验设计来看，设立CD34+CD45的双参数十字门是为调整R3的位置来设置的哦。
6 w' \' r% {! R' J' H6.关于R5门的画定，有时候左边的杂细胞群挺多，R5的位置不是那么好花，很担心是把单核细胞群画进去了。

nailute1985

回复 SKC-SFC 的帖子2 O( p" G+ K  K0 t

$ g+ `0 T* X- \8 n9 y5 p0 }/ Y1、你们是研究，我们是临床，所以肯定成本我们会考虑进去，cd133成本会高很多。其实绝大部分的造血干都会表达cd34，剩下的只是极小一部分
4 r8 R1 z  H0 ^: K8 Y7 d  Y3、R3可以基本确定，R4的用意确实是为了验证这群细胞是否在淋巴群里，但是我觉得r4是很有必要的，因为如果你看r4的流式图的话，会发现r4的范围很宽，所以最后圈r4还是有必要的。不能全圈上，不太准。% P7 U. @# T( h4 A9 M. m0 X: X- I
4、fsc／ssc这个是必须的，无论做哪个标记。这个就是最直观的看三系分区的状态的。, T) M% h; O5 Y
5、其实十字门也不是不可以，但是对于逻辑门来说更合适，十字门分区并不是很准确，会有压线那种情况，不好区分。" |, u  k! \. F' u
6、这个是比较常见的状态，因为这跟你去红去的干净不干净，或者血液本身的质量有很大关系。

SKC-SFC

回复 nailute1985 的帖子7 B9 O8 y7 ], J) P6 Q
  ~& T$ [! X; m- P
1.我们也是临床，只是老板希望我们先累计CD133的数据，通过将CD34+和CD133+的数据进行统计学的分析，若无差异的话，就可以采取CD34+CD45直接进行标记检测并分析。
6 O* e3 t3 X% H; y" J/ r2.从您表达的意思来看，造血干细胞应该具备以下几个条件：CD34+，CD45弱阳性，这群细胞是位于幼稚淋巴细胞群里？& c* _3 |  u( q4 K3 J
3.我们画R4门，就是在FSC/SSC的散点图中画的。6 q0 G% s  B. }3 r3 W7 v9 _
4.关于十字门我赞同您的意见。但文献都这么做，不知道是为什么？
; J+ r' M* G/ o+ r, A6 A  Z. b" ^; X5.我们去红还算是非常的干净，有时候做出的我图和文献上一致，结果也好分析，有时候回有左侧拖尾的情况，我们一般是通过调大阈值来去除干扰。因为我们的设备不需要调电压。) F3 g: ]7 \) v
6.最后咨询一下CD34+CD45+CD133做同型对照的实验设计.
* ]. r' {2 ^/ }谢谢！

nailute1985

2、并不是cd34+和cd45弱阳，而是cd34+与cd45+的那一群圈出来之后，相对再找出cd45弱阳的那些。对，位于幼淋那片& `! [) X! C$ N0 U' q7 T) H
4、十字门在文献中很直观，直接就能看出来双阳或其他的，不像逻辑门，还得一步步分析，文献中是没办法解释的。" C3 F  Z4 m4 ?- i+ ~2 L6 |
6、isotype的话，很简单，不就是要去除非特异性的么，所以只要把cd34和cd133换成同性对照就ok了。cd45依然做阳性管7 n4 L+ _' U- i' w1 e, E/ ?! n

fm100200

学习了

SKC-SFC

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# Y, s# C8 ~0 W5 S+ o+ @' E0 |8 o5 N' }" |9 z8 c
谢谢.

yuanyecat

上图啊没图没真相啊