求助ips复苏的问题

冬天的雪糕

我们现在用的小鼠mef饲养层，复苏is细胞，但是两周了细胞都没有长起来，只有一两个克隆，而且克隆一直没有生长。
5 r! K! M3 A/ l; _3 m; m) @有没有大神试过用饲养层复苏，而不是无饲养层培养液？有什么注意事项或者建议吗？
5 a. E& K# T7 N) c非常着急！！

nichifanlema2

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! e' r' T6 J" _1 z5 y6 L1. 冻存的干细胞状态对于复苏效率有较大影响。7 T3 r& `- G) W8 I( D& v  k
2. 37度快速复苏、稀释冻存液和离心过程严格操作，不要吹打过于剧烈。/ x. M- G- G. r
3. 复苏后为提高效率，可以加入Y27632。
! T) u8 v! w# j$ s5 j0 ~$ b, N4. 常规培养用可以细胞团块的形式冻存和传代。; z0 N8 F" ]8 D6 x/ K
5. 克隆生长缓慢或者不生长，可能是饲养层太密了，也可能是培养基已经不支持生长了，可以降低饲养层密度或者每天更换培养基。

watchen198891

楼主可以简单说一下你复苏的方式不？同意楼上的说法，还有其它的方面的问题，细胞冻存的方式，复苏的方式，冻存液的配置，复苏时离心的转速以及复苏时细胞打散的方式，太多方面的问题。还有就是你MEF本身的问题，MEF数量以及状态等。

冬天的雪糕

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6 Z0 R2 _* G2 R& M7 [* f) D( t% S( i, z8 k9 e
冻存的细胞状态还是不错的。y27632没有加，下次准备加了试试看。饲养层密度还可以，是天天换液。现在看来有可能是把细胞打散了，请问稀释冻存液加3ml每管可以吗？离心转数和时间请问应该是多少比较好呢？万分感谢

冬天的雪糕

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mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

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mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

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8 W$ I( G* @% F: s5 z: ^% \mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

nichifanlema2

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细胞吹打过度会加重细胞死亡，稀释冻存液时要缓慢滴加，一般4-10倍体积稀释没有问题，但是5倍以上稀释可能没有太大的必要，因为一方面浪费培养基，另一方面离心不太容易。可以1000-1500rpm离心5min，或者200g离心5min。