求助ips复苏的问题

冬天的雪糕

我们现在用的小鼠mef饲养层，复苏is细胞，但是两周了细胞都没有长起来，只有一两个克隆，而且克隆一直没有生长。
$ X/ U( {+ E  O4 l有没有大神试过用饲养层复苏，而不是无饲养层培养液？有什么注意事项或者建议吗？
# a" F+ M2 n6 P+ h' V% G& Z' V: Y非常着急！！

nichifanlema2

回复 冬天的雪糕 的帖子( P: z. n5 D! x
$ x9 r7 s. Y( p! q) `
1. 冻存的干细胞状态对于复苏效率有较大影响。* A: Z( N$ L* }" B& d! d1 P
2. 37度快速复苏、稀释冻存液和离心过程严格操作，不要吹打过于剧烈。0 O  w1 o" ]& L7 ~' {5 v. @, f0 u
3. 复苏后为提高效率，可以加入Y27632。% |$ @% |1 G0 }- m* c8 }  G* G
4. 常规培养用可以细胞团块的形式冻存和传代。
9 }8 N9 b4 ~) J' O/ s6 c! d8 i5. 克隆生长缓慢或者不生长，可能是饲养层太密了，也可能是培养基已经不支持生长了，可以降低饲养层密度或者每天更换培养基。

watchen198891

楼主可以简单说一下你复苏的方式不？同意楼上的说法，还有其它的方面的问题，细胞冻存的方式，复苏的方式，冻存液的配置，复苏时离心的转速以及复苏时细胞打散的方式，太多方面的问题。还有就是你MEF本身的问题，MEF数量以及状态等。

冬天的雪糕

回复 nichifanlema2 的帖子- Y7 a8 M  `# Z2 b) W$ m
* J* g0 l' H2 p. X* i# E  I& L
冻存的细胞状态还是不错的。y27632没有加，下次准备加了试试看。饲养层密度还可以，是天天换液。现在看来有可能是把细胞打散了，请问稀释冻存液加3ml每管可以吗？离心转数和时间请问应该是多少比较好呢？万分感谢

冬天的雪糕

回复 watchen198891 的帖子
& S' v# S2 r+ G! R/ e1 a
3 j. b4 @! Z- w) w" bmef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

冬天的雪糕

回复 watchen198891 的帖子
  I- I$ ?# z3 ]
3 L! {6 r4 z- g1 O* fmef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

冬天的雪糕

回复 watchen198891 的帖子3 `8 a4 b( Z' p9 Q
8 A; ?0 @& i& Q) H& i" R2 B
mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

冬天的雪糕

回复 watchen198891 的帖子
% J' |' s1 J4 X* ~& G& C2 x( l
( v+ [' }% d/ C# }mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

冬天的雪糕

回复 watchen198891 的帖子
5 K" q6 z. P) S* ]! J9 Z+ g6 e7 O( s) K
mef的问题应该基本可以排除。我没有加y27632。细胞是吹散的。请问复苏时应该把克隆打散吗？离心时间转数应该是多少呢？还有就是请问y27632的浓度应该是多少呢？是不是加到培养基，直到克隆状态良好，在更换培养基？

nichifanlema2

回复 冬天的雪糕 的帖子2 ]2 `; K. ]- \
. D: L  R2 q" }/ o, K& c) s
细胞吹打过度会加重细胞死亡，稀释冻存液时要缓慢滴加，一般4-10倍体积稀释没有问题，但是5倍以上稀释可能没有太大的必要，因为一方面浪费培养基，另一方面离心不太容易。可以1000-1500rpm离心5min，或者200g离心5min。