关于Splinkerette PCR的一些疑惑

jiabiaohu

回复 splinkerette 的帖子( n+ h0 c% D' G' `

5 I4 \6 |, s4 a7 ^) g: d2 wsplinkerette  你好，看了你推荐的那篇文章，很详尽，有个问题想请教下，在这篇文章中，splinkerette 接头连接后，还有一步EcoRV酶切的过程，但是LZ的没有，当然分析来说两种方法都可以，但具体到结果上会有什么差别咯？

splinkerette

回复 钻石星辰 的帖子, \: |+ G$ E" I* v

! I1 ~- i6 V5 U" m1 @平时合成的普通引物，两头都是OH，我估计文章中所提到的不磷酸化，应该也是指5‘端的。不过这些个问题操作起来都不需要考虑的，直接把序列发过去合成就可以了

splinkerette

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+ H4 \% N8 A7 ]# u7 X
( }! J, Y# D' E& H; F具体到结果上的差别我就也不清楚了，EcoRV 的酶切应该就是为了简化PCR的反应体系吧，或许能减少一些非特异性的反应。如果在你针对于“Transposable Elements”设计的下游引物之后有合适的酶切位点的话，我建议还是不妨一试。 不过至少我做的时候省略了那一步，也能出实验结果

jiabiaohu

回复 splinkerette 的帖子% b) {. Y9 n7 I8 O; ]/ g7 \+ f

) l, b+ f; _/ ~, g; ^; S3 Q/ i我这个下游没有合适的酶切位点，所以方法可能和你的差不多咯~~~~ 能不能提供点详尽的资料（比如接头合成，具体实验步骤之类）咯~~~~虽然那篇文章很详尽，但还是怕出差错~~~另外，看到一篇protocol说Splinkerette PCR容易出非特异性带，不知道你的实验结果怎么样？6 U  f" S) {6 i8 b5 K
就等着这个结果毕业了，盼回复啊~~~~先谢过了。如果不建议的话，是否可以加QQ聊咯？我的QQ 348580917

jiabiaohu

回复 jiabiaohu 的帖子
( ^( G" r$ ~, j: D0 }; b5 U
7 e- v% F+ w. Z2 r7 q( T- v附件中是其他一些基于Splinkerette PCR 的改进方法~~ Isolation of Genomic Insertion Sites of Proviruses using Splinkerette-PCR based .doc (383.5 KB)

2011-3-17 12:23 上传

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jiabiaohu

回复 splinkerette 的帖子, B! l( o0 }  n4 N0 T1 g& v9 W

* D# o; F4 j# x6 l, o合成的接头5端要加接头不？急~~~~谢谢·~

splinkerette

回复 jiabiaohu 的帖子) k. S& W  w1 c. U  X( t8 k9 l" r
6 x9 \% Q7 W6 T0 |" E7 a  V) m
不好意思，我没有太看明白你的问题

jiabiaohu

回复 splinkerette 的帖子$ S' ]( P" U( s. {5 h3 O
( n, q4 b( X0 C! u7 Y5 e+ d+ M
呵呵，不好意思咯，打错了，问题是“合成的接头5端要不要磷酸化”，后来查到了，好像是说不用磷酸化的，对吗？

splinkerette

回复 jiabiaohu 的帖子; V# g" |' `( W/ S1 V. K( R

' [0 _$ W6 s( P1 m# R  e4 N对的，像我之前说的那样，类似于合成引物那样，直接送出去合成就OK了

jiabiaohu

回复 splinkerette 的帖子8 Y$ T, G- H5 C# Y! ^  r

: j! _! x" J$ w9 r* }好的，谢谢咯~~