关于Splinkerette PCR的一些疑惑

钻石星辰

大家好，最近要开始做一些splinkerette PCR的实验。目的是检测transposon在genome中插入位点的位置和数量。9 V3 q+ A5 b- P2 L  \+ D1 M8 O

5 k1 ~( K; ~. Q0 U/ ~! \" `我查到一篇名为《Splinkerette PCR for Mapping Transposable Elements in Drosophila》,它的大致原理如图：5 `0 z) J5 X+ J3 @8 f

% O3 _; o$ h% f1. 全基因组DNA提取
. Z: J. }2 X$ X' Q- p. t2. 限制性内切酶酶切全基因组DNA，获得"GATC"粘性末端
; x, ^% m" ^( c$ Y- Z, j3. 酶切好的DNA片段与splinkerette adaptor连接
# F( {1 n: a. E) ~' P. T4. 1st-Round PCR# F  k2 U! K$ `4 q( g9 \
5. 2nd-Round PCR1 U) n; s4 U- o1 \: q3 Q9 b
6. Sequencing
' n9 [# r2 r3 m9 Z# I$ `* Q' N! f
" V+ `0 a+ ~" h+ J现在有一个问题比较困扰我：2nd-Round PCR的产物是直接拿去测序，还是先在胶上跑一下切胶回收再拿去测序？
( j5 }& P( {+ u4 g因为如果transposon的插入位点有2个以上的话，2nd-Round PCR的产物将是一个混合产物。这样不好测序吧？
0 n( _; e- T4 ]! y" H5 a: E0 u- A  c7 ~( |, U$ e. R* q
比较着急，希望高人指点。谢谢~& M  K6 ~0 {- n+ S+ T: i. B6 I

" P' F7 J7 y2 H& B3 \; i附原始文献提供的splinkerette PCR Protocol

splinkerette

LZ您好，首先我建议您参考nature protocol上的一篇文章：A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites，相比较而言我觉得更有参考价值  in Drosophila的那篇文章我就只做个参考。对于您的问题，当然是要先在胶上跑，再胶回收分别去测序的啦。希望对您有帮助

splinkerette

附上文章

钻石星辰

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; m+ g- [* |  y- @( @# z
9 m. O, Z- c# Y2 u谢谢您，这篇文章我有，不过后面的Sequencing Analysis没太弄明白就没深究了，没做过这方面的。。生疏一些，我再仔细看一看，不懂再请教您可以吗？

splinkerette

呵呵，谈不上请教。交流，交流哈

钻石星辰

: C, D; ^7 h- B% k
3 {' o( P: O* c回复 splinkerette 的帖子: s  k- Q/ i3 X

3 g* y5 J' i, w  J! S你好，我看了那篇文献，出了后面高通量的测序方法没看懂其他基本没有什么问题了。因为我们的插入片段不会像病毒那么多，所以我们就直接电泳然后切胶回收测序就行了。6 b  _" y6 \8 P  L" X5 m( a
9 S) W+ ?3 A3 X; W6 M- [
不过，我还有两个小问题：
9 z- }( P. F/ ]5 y- ?4 _  C. Z- W" Q" R  Q8 H9 v8 t
1. 不过发现文献中的genomic digest体系配比中有一个“Acetylated” BSA。
8 b! a3 O5 G% N. W& m这种BSA在NEB中有提供吗？还是就是一般普通的BSA？& B4 o, M$ M3 V  q; I
" c( i  n0 p: l
（没有用过NEB的酶不好意思）8 @( K; Z2 v' @$ v' B+ I
3 X5 `. s( m7 c% Y( {9 B9 M0 ^: h
2. 请问必须要用4%的胶来分离nest-PCR产物吗？其它浓度的可不可以？3 O9 J) ^+ k/ C- M+ `& X) O

! Y8 e! B/ E9 I/ ^

splinkerette

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) L' b2 @3 N9 E( @$ b) \) m你好，高通量的测序方法其实我也不大懂的，老板说那个都是让公司去做的。我也就不管了~所以我们也是按条带切胶来的。( G2 H" i/ u, U% G" O5 z
  g; V& }" I2 |/ C
两个问题：
1 P% B" ~9 t3 ^2 q/ l  R1.就按照酶切的那个酶 说明书里的酶切体系就好，酶的buffer里头就是含有BSA的，
  c8 m. w% [0 c5 f/ E/ w至于文献中那个Acetylated BSA就没管了，无非就是一个环境嘛，酶起作用就OK。0 H8 K2 J! a. g% L2 {* N  m
; b5 k9 K3 _) E
2.当然不是一定要那个浓度，而且4%的胶也挺不好操作的吧。。可以先弄个2%的胶试试条带大都在什么大小区间，然后再调整浓度好让条带分开，便于切胶& }  b) A: t: R. j  [( f* [- f
附上一个图吧：# K9 V5 m2 y% X. r% e6 h; [

splinkerette

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5 ^) |5 e" W( a9 s' U+ ^0 B; `, y' {- N* |
P.S. 不好意思，积分还不够，所以还不能加好友和回复您的留言，抱歉。。。

钻石星辰

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2 q& C* [- L+ n. n$ b+ Q
+ h( V0 m1 I4 Z% C2 \谢谢！最近在设计引物，请问splinkeretter引物是哪一端不磷酸化的呢？是GATC末端吗？

jiabiaohu

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7 e* q% v% \% r' e8 J8 {9 F5 d2 Z, [( S
测序单上一般有PCR引物测序的，一般有两个选项，PCR纯化产物（即你跑电泳后割胶得到的），另外还有一个PCR未纯化，这个你也可以直接送过去，当你注明之后，测序公司会给你纯化的，当然测序费用可能要高些~~~