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41楼

发表于 2013-10-24 11:02 |只看该作者

DC-CIK细胞的制备方法
【背景】& S. j4 Y* h9 N. [+ G) U# ^/ q8 V
  CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。& j* x- B0 }9 l7 R
DC是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家RalphM. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。
   DC-CIK即DC和CIK细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。* r0 E2 R# N( t) r* l( D8 B) g
【培养原理】$ i8 `; T% A/ _# `. W* n
1．DC培养用细胞因子：
GM-CSF( 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 ) ：% x" y# S: S) ]
  GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活。0 {# L1 Q8 \: [
IL-4 ( 白细胞介素- 4)4 r7 ^+ h+ ^) q3 E+ i* P
IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，  但不表达CD14。
TNF-( 肿瘤坏死因子- )
TNF-可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的激活T细胞。& C; {, i+ \8 W* u3 W! R5 i* [, Q
2．CIK培养用细胞因子和抗体：
CD3 激发型单抗：
T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶 (Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸 (Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。2 Y- l% M( J' x7 f% a6 R
IL-2 ( 白细胞介素- 2)( D; B$ K/ D- u$ T; H( H
IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。* G% q3 Q' \, {5 s* l7 x# E
IFN-( 干扰素 -)
IFN-;具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN- ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN-，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。# j) u4 k# G6 ]0 A0 ]+ G
IL-1- (白细胞介素- 1) 　1 e0 {7 v! M$ n
IL-1也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1与IFN-和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK 的细胞毒作用。8 p( \2 z% V" m7 Y8 ~. u
【细胞制备】2 ^& d  K) Y/ ?, I& G8 q( e: \
1．外周血单个核细胞的采集, z$ k+ v4 H4 f! @: w) U
   1.1    用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；# r- p- Y; j) E; _
   1.2    淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。. c, Y: v9 p4 H! o4 q6 y
   1.3    无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 108。
2．  ( 可选步骤) 肿瘤抗原的制备
            用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。用TSA或TAA负载的DC具有很好可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T 淋巴细胞(CTL)克隆，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
      2.1    手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；
      2.2    无菌生理盐水洗3次；
      2.3    用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；
      2.4    200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；; Z9 T* z: u1 N; U: ?+ N, @
      2.5    用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；0 I0 b) Q" z2 [$ A: l2 K/ i  R
      2.6    将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。反复3-5次；
               注：也可以 -80oC/37oC 反复冻融 3-5 次。; j% W2 @' Z* Q2 m
      2.7    将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；  e" p- b) K3 r* n- ]4 b' d
      2.8    收取上清，0.22mm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
      2.9    -80oC保存备用。6 Z8 E, U* i% M
7 Z1 r: k! k$ R) H7 _9 i" @9 Z
3细胞的培养及鉴定
      3.1    步骤1中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；% E4 r* U. ~5 Z
      3.2    37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁;1 F, N* D" x& _
      3.3    收集悬浮细胞，． CIK用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 106/ml；3 ]! B6 p* D& X1 P- W' k
      3.4    加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g培养；
      3.5    24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；+ a- L0 s+ Q  {; C+ l7 d, e# c7 @
                  注：此时也可同时加入 100 U/ml 的重组人 IL-1  。
      3.6    每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
      3.7    在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x 109个以上。
      3.8    CIK细胞质控：
               3.8.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
               3.8.2  用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明. U. X5 b! I) R2 O$ H! T
                           显提高。; Z0 W; a- ^4 z6 Q9 |6 P) r

4． DC 细胞的培养及鉴定: W  o" q$ S$ x8 f3 {- H0 v
      4.1    步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人3 l: J+ c7 ?4 u* C+ X
                  IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；
      4.2    每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；
      4.3    (可选步骤) 在培养的第5d，加入步骤2中获得的肿瘤抗原50 mg/ml，对DC进行抗原负载；
                  注：若不对 DC 进行抗原负载，该步省略。
      4.4    在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC 细胞成熟；
      4.5    在培养的第7d或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106个以上；
      4.6    DC的质检：
               4.6.1  台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；) ~# l9 t0 ?( t: @) Q* |: W; N, S
               4.6.2  流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达，以确定DC是否成熟。

5.    DC-CIK细胞的制备和质检
      5.1    收集步骤4和步骤3中所获得的DC 细胞和CIK 细胞，按1∶10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添: c* t% P% i+ b5 Y3 N+ k/ [
                  加重组人IL-2 (300 U/ml)；
      5.2    每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。
      5.3    在第7d 收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；0 P& J& e  ?5 b9 u7 w# z7 b1 h
      5.4    DC-CIK细胞的质检：
               5.4.1    台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
               5.4.2    流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%
                              以上。
               5.4.3    细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶
                              细胞，将效应细胞与靶细胞按10 :1(数目比) 的比例加入96 孔U型板中，每孔含靶细胞 1 x 104
                              个，终体积为200ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检3 E+ X( i. h' J
                              测效应细胞对靶细胞的杀伤率。3 y' D9 ?( |0 y9 J/ ^
               5.4.4    收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病: d! L9 x; w3 \
                              原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。
【步骤简图】' t$ ]) {+ [& r$ _4 s" I
                  * v; v5 a) w  b* U