|
- 积分
- 5
- 威望
- 5
- 包包
- 38
|
DC-CIK细胞的制备方法 ]" I, m, W5 Y$ z! d
【背景】
% e2 u5 {" q+ v' E( I* S9 z CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。4 R6 Z; _6 w; |) R7 k2 d {
DC是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家RalphM. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。# l3 L+ c+ v( M0 ~. M# g8 B7 k4 s' [
DC-CIK即DC和CIK细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。0 [3 ~' M' Z7 P2 | |2 ~
【培养原理】2 m3 W7 r3 H H' a; }
1．DC培养用细胞因子：2 p) }: o* Z n" x i6 f# p
GM-CSF( 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 ) ：! W* l# t+ \& g
GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的 功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。 此外，GM-CSF还可促进DC的存活。& A% C# j# ]! z, a a
IL-4 ( 白细胞介素- 4)* ~' P7 ], \7 @6 {% M9 M* K
IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)， 但不表达CD14。0 H% N; p1 o6 m& ~3 |# f
TNF-( 肿瘤坏死因子- )$ i) z! \3 L2 a) j/ h
TNF-可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的激活T细胞。/ V: t J1 Y; W" P0 I
2．CIK培养用细胞因子和抗体：
8 N1 J, u+ }1 n2 Z3 R% @2 TCD3 激发型单抗：: n% Q5 J0 W0 W. D
T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶 (Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸 (Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能 够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。 此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。
) D3 ~( G' Y; w- Y+ Z' S IL-2 ( 白细胞介素- 2)
/ C4 G# [8 I. B; U- Y! hIL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。
' [2 C1 a! n/ C( d5 ^# s& p9 w IFN-( 干扰素 -)( v/ S( K% x) ?5 q
IFN-;具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN- ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN-，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。3 C: |. i& I* M& J
IL-1- (白细胞介素- 1) 6 N& s! l# x* F8 R% ^" K$ }" j/ ?
IL-1也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1与IFN-和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK 的细胞毒作用。: L, @( X6 i% [
【细胞制备】 f# o. [* J) K
1． 外周血单个核细胞的采集
a3 i/ C# F2 d/ K- c. y( x 1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；
3 ]! |5 u$ e) ]8 z& _8 Q( J 1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。# J5 @' Q- z5 w6 n, o6 C9 p7 Q: ^: e
1.3 无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 108。
5 U% S2 i% o4 Q5 p$ }2． ( 可选步骤) 肿瘤抗原的制备 + O8 j2 E4 s* l. M* Y$ r6 @* p
用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。用TSA或TAA负载的DC具有很好 可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T 淋巴细胞(CTL)克隆， 从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤 活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：- b @3 a# h4 L5 F) V
2.1 手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；* o, U4 T! l% k
2.2 无菌生理盐水洗3次；! S5 F3 t8 Q3 E6 k9 B7 F! {
2.3 用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；0 Z4 v! s1 Q4 |7 k
2.4 200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
/ u" M% n' \. j G I 2.5 用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；
4 T4 d/ b/ `2 M: |7 \2 X 2.6 将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。反复3-5次；
}& V" ]. V! k% f/ L) o 注：也可以 -80oC/37oC 反复冻融 3-5 次。1 k5 L- P- s4 B- z; Y3 p2 ?
2.7 将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；- l$ V! F) O J1 l
2.8 收取上清，0.22mm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
4 c3 y. @7 u4 F, A; s( ] 2.9 -80oC保存备用。: R: f+ b# [" s( C F1 v8 B' |
0 _6 A3 p: M6 G* L3 p
3细胞的培养及鉴定6 Y/ d _- b" B, V: O9 p: a
3.1 步骤1中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；. S8 E3 v' I' a- p
3.2 37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁;
; V' A3 w) {2 J7 D% D 3.3 收集悬浮细胞，． CIK用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 106/ml；8 l* r( g9 z9 q4 t9 W S+ P. H
3.4 加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g培养；
0 n: e' K5 U0 B0 v4 D 3.5 24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；, | n) w Y) ^' T8 K
注：此时也可同时加入 100 U/ml 的重组人 IL-1 。& Z) x9 ]- G7 e3 r4 [) h
3.6 每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；, [3 R$ @$ l( |: m, f1 f
3.7 在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x 109个以上。
# j+ F5 q S5 I" {/ [1 ` 3.8 CIK细胞质控：; s5 z$ E& w) J9 o# U2 t8 F9 B v
3.8.1 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
7 V+ ]5 e M# D% C: } 3.8.2 用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明
+ F0 m7 G" p/ g) ? 显提高。1 d# [. Q2 k" \
/ d: n8 I5 |; l$ A7 l- J' Z9 ^
4． DC 细胞的培养及鉴定* g& \9 {( Z9 [0 o
4.1 步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人
0 U* H5 k% l) L. c1 g IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；4 L2 H- q* V5 w) y
4.2 每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；6 {" b. a6 E8 i2 t2 r- b, t
4.3 (可选步骤) 在培养的第5d， 加入步骤2中获得的肿瘤抗原50 mg/ml，对DC进行抗原负载；
0 M0 V$ Y4 P$ N, L9 a' t* K$ |- ~ 注：若不对 DC 进行抗原负载，该步省略。
( a ^5 }' ]& k7 @- f' \/ M 4.4 在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC 细胞成熟；
0 `% w: L4 r" R/ Y5 | 4.5 在培养的第7d或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106个以上；
* |) d* P& i0 u! U5 @& t* J 4.6 DC的质检：
1 i) {5 W0 s. z- p; A 4.6.1 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
' I/ ]2 Z5 }! I4 A" C 4.6.2 流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达，以确定DC是否成熟。
' B3 X6 ^" I; U6 P0 m# z ' R4 j! e; j' Z& k
5. DC-CIK细胞的制备和质检6 s' b4 S9 T+ G
5.1 收集步骤4和步骤3中所获得的DC 细胞和CIK 细胞，按1∶10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添
% g+ c4 q1 H8 f 加重组人IL-2 (300 U/ml)；4 a3 S3 U$ v9 [
5.2 每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。
. {0 }% y% }9 R, D# b. Q' z 5.3 在第7d 收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；
, R3 m. v' O! O! p+ ` m 5.4 DC-CIK细胞的质检：1 c7 _/ B2 F w: T( w" ]- h
5.4.1 台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；4 `9 [, p/ s4 { o, J" B! ~
5.4.2 流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%
1 P1 C3 a& C+ f 以上。
5 n- k t$ _ F2 j, A 5.4.3 细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶1 L" {3 e2 i3 r
细胞，将效应细胞与靶细胞按10 :1(数目比) 的比例加入96 孔U型板中，每孔含靶细胞 1 x 104- C" H1 K; D( P/ Q% U3 q
个，终体积 为200ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检
$ |8 k5 m5 k7 Z$ r! |5 }) w* U 测效应细胞对靶细胞的杀伤率。* D! c2 M; C: j/ N# W4 v% P
5.4.4 收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病6 c1 z* e6 C* O4 f+ {( Z% r
原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。
* g8 D% Y3 G7 e; W8 S/ X% z+ J【步骤简图】
, {; T. U5 q5 y2 C# d
! E" ?7 r. e1 P" A! b% s9 m |
-
总评分: 包包 + 5
查看全部评分
|
发表于 2013-10-24 11:02
