请教如何去除多克隆位点？

军医

我想去掉载体上的原有的多克隆位点，在别的位置加上其他的多克隆位点，我用两种酶将原来的多克隆位点酶切后用klenow将粘性末端补齐，再用solution Ⅰ让该线性分子自连成环，大家看看这样做对不对？谢谢了。

深海寂寞鱼

to 军医：5 l' w- J& A+ W* N" L
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     设计没有问题。大胆做就可以了。8 h7 v7 r% J  Q* H
   9 |- N/ e5 J% F- i
     几点建议：
. K! _- n$ G& T  d. M5 O# Z4 ~
$ a1 G5 `+ U7 p5 s; E5 ]) _/ b7 `     1. 注意排除 平末端连接后产生“移框”等影响表达的可能! c* o4 j1 L2 E. z: p1 V: \

5 |5 `+ x9 H/ z1 \; M4 X4 c- H     2. 平末端连接后是否会产生新的酶切位点* c8 {* }, Q( }1 d6 {. L2 }
6 j' e4 e' s! R7 Z
     3. 如果经济不存在问题，平末端连接完成后最好把连接部位测序。6 x, S* N( G- G0 q9 c

5 b4 h) D8 N4 A; i8 W3 M% Q         因为有时候平末端连接后会少一个碱基或多出来一个碱基。# h( ]4 c( C( _. F5 B, \. ^
       （概率不高，但是确实会发生。绝对经验之谈。）: D  R0 o& C8 I2 N

6 G& J& K  |3 l$ z
' ^$ I+ w9 I' m* V! n: i       希望实验顺利。

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子" Z8 `7 I5 v( p7 ^1 |- B
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谢谢提供宝贵意见。

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子: Z4 {7 J* Z! r

. H* n- v* M4 E' x请问补平后的分子内自连要加连接酶吗？有人说直接将线性DNA转入感受态中便可以自动环化，这样可以吗，我用宝生物的solutionⅠ将它自身环化，转化后挑了六个单克隆，六个提出的质粒电泳显示大小都不一样，那pEGFP-C1作对照，CI比六个提出的质粒跑的都慢，让我很难解释。

深海寂寞鱼

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" ^5 H5 U9 r  ^+ ~; \  G1 Q; wto 军医 战友
. }) z3 q' L3 y7 j0 o% D' _: N( r1 o8 G2 |5 `7 C
    DNA确实有自连的可能性，但是几率不高，因此推荐你加入DNA连接酶。+ ^/ v, i% A4 J. ~$ G+ f) s5 S5 [
2 @1 C" J! ?! s8 x& N$ n
    你用环化质粒跑电泳，条带的位置确实变异比较大。
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    建议你用单酶切将你的质粒线性化，然后再跑电泳。% ?" S6 E9 F: T5 j
% O: j$ y5 ?) ?2 l
    这样你就知道你的质粒是否正确。

xiangchou812

除了你说的用最外侧两个内切酶切割后再用T 4连接酶进行自身连接之外，还可以用同尾酶进行切割后再连接，比如：XhoI+SalI。另外用Klenow补平时要注意，其只能补平5'突出末端。自身连接的效率是很高的。
9 v$ v: \, _6 w+ h2 |5 V( E另外，环化的质粒电泳不好比较大小。还是线性化再比较吧。祝实验顺利！