关于转染问题

苏眉1989

我记得我们实验室的战友们都说贴壁细胞特别是293T比较好转染，但记得干细胞之家中有人推荐把细胞吹到悬浮时转染，不大明白，特来请教各位高人？另可不可以问下关于那种转染方法适合哪种类型的细胞转染，简单原因，谢谢！

wwy551

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( }: p+ V5 l: S) k3 P7 c5 e) k4 w: h4 p' s0 \! u- J" e
贴壁培养的细胞用离心的方法转染病毒，效率确实比较高。
+ h9 Y$ \& j3 q. p. }之前也有人问过ES转染的问题，当时我建议把ES消化成较小的克隆，悬浮转染，因为如果不是用电转而是用病毒转染的话，直接转染贴壁的ES克隆，效率会很低，因为正常生长的ES克隆本身很致密，不利于病毒转染，但是消化成几个细胞的细胞团块的话，相比直接转染贴壁克隆，效率肯定高很多。
; A# S! H! R/ h* E4 \" u5 c" E: B你所提到的转染293T就是一般转染贴壁培养的细胞，就这样正常培养状态下加进去病毒和1000×的POLYBRANE，37℃孵育1小时，离心转染90分钟，再37℃孵育一段时间（从加进去病毒转染到换新鲜培养液时间控制在4小时以上）就可以了。

yuyan

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; s/ }+ a" j% b4 }
7 }2 B' ]. f) ~& n# J你好！  q0 |6 O2 H& i( O3 b& y/ [
请问加入病毒后怎样离心90min？
% ]. ~" ~7 k" J0 r" B. n是要消化到离心管中的吗？用多大转速呢？0 }( V9 E+ `# W6 Y8 _$ e% h
谢谢！

wwy551

回复 yuyan 的帖子5 a0 e% D! l% ?2 J6 O3 _: A9 O
; b' n, J' m: F+ Q9 M
用专门能离心细胞培养板的离心机，这个应该很常见的。离心转染的时候就是细胞很自然的贴壁生长在孔板上（六孔板，十二孔板，二十四孔板等各种不同规格），离心之前首先加病毒和1000×POLYBRANE在37℃孵育的时候，培养液体积适当小一点，以便转染的病毒有较高的滴度；离心前补新鲜培养液（比如正常条件下，十二孔板每孔1ML，离心时的体积可以加到2ML），以防离心时，培养板倾斜造成半边贴壁细胞干死。

yuyan

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$ I4 i5 e0 T( c: I( g# i) a5 W/ W2 Y" R8 ^( e( D
非常感谢！
3 W8 `9 t" t( z. }  d, n# W7 i/ G应该是离心384孔板的那种大的离心机了。' E# c" K+ U8 X) R# p7 h& m' B' T2 `
那么离心过程还需要在细胞房中进行吗？" e5 F: a% S, y4 ]; S$ x, h
转速要多大呢？

wwy551

回复 yuyan 的帖子& S1 z( Z( R$ P) }( n
) q' W4 n8 D- h
384孔板？这个还真没见过，我们实验室最多也就用96孔板。离心过程在不在细胞间不重要，当然还是要保证无菌。转速2500RPM，90MIN，33℃。

eley

一般转染的时候不要把细胞给悬浮起来，因为这样也是对细胞的一种伤害，应该把把细胞静置在最佳状态。, ~/ @) u+ b2 M' F9 O9 m" j2 D
如果是使用 Lipo，那就直接按照Protocol上说的就可以，8 d+ o1 T# s3 r0 ~  @, O+ s3 G
如果是钙转，我现在一直使用的是BES，而且我自己的小窍门是就是，在加入质粒之后，不要急于6-8小时换液，而是要往里面加入培液，就是12小时加一次，24小时加一次，然后在进行换液，或者收蛋白。
; G" D5 U  x  w5 Q* F5 A, K) W因为细胞是吸收沉淀颗粒，如果换液的话，会把沉淀给吸走，如果只加培液，这样沉淀还在，长出新的细胞还可以继续接受沉淀。所以转染效率高。! [( K' T. \3 n0 P% j# f2 C5 b
希望对你有帮助~~~

wnavy200299

离心转染---第一次听说啊~~~~受教了！
0 _2 H7 O) v2 V  G不知效率比普通（正常）转染高多少？或者说高不高？高多少？* ]  H; T/ R! d) n: W
因为效率是第一的，在效率是一致的情况下，过程越简单越好！

huangcong1988

贴壁细胞特别是293T比较好转染？Are u kidding me ?貌似293T贴壁不是很强，而且易成团，虽然293T转染效率是挺高。干细胞之家中有人推荐把细胞吹到悬浮时转染，这个我真不知道怎么说了，因为在做293T转染的时候，一般是贴壁转染，而且之前我做的时候，由于在混匀的时候把细胞摇起来了，效果很不好，所以混匀时摇轻。

aminhair

路过，学到新东西了。