miRNA引物

kaxdd

我要鉴定miRNA，想问下，miRNA的特异引物怎么设计。对这方面了解很少，希望大家多多指点，谢谢。

runsong

不太容易一下子讲清楚。$ y( ]  n) a5 a) r  d0 j0 {8 @
我们这里用所研究的miRNA的特异性颈环反转录引物分别反转录出各自miRNA的“cDNA”，同时在“cDNA”中引入通用序列。4 T: e, o" w, b8 l: c6 k& v
再设计miRNA的特异性上游引物，连同下游通用引物做定量PCR.
8 {# g+ l- C9 ?8 {不清楚的话再与我联系吧。

langziforever

回复 kaxdd 的帖子8 e7 H7 {* U  M8 v! J
$ p( f& D# f/ s2 ^5 q' c; e0 y/ {
这个问题不知道怎么回答你，按照你的意思，应该是你已经知道了这个miRNA的序列，而你的目的是要在不同条件下检测miRNA的表达？那如果是这样的话，你要设计引物，应该是想要使用realtime PCR的方法来检测，由于miRNA太小，所以，设计引物的选择很少，所以，也相对比较简单，目前有很多商业的试剂盒可以选用，需要你可以自己去搜索一下。我搜到一个图片应该可以很好解释你引物设计的问题，一般是利用一端颈环结构的引物和另一端序列特异性的引物，使用染料法或者探针法进行检测，但这个是用在qRT-PCR上的，还有一些其他可用的策略到达对miRNA定量和检测的目的，比如northern blot、或者做RT-PCR后克隆测序的方法。6 s7 y: O& Z2 D) z* n1 ?. R( K

runsong

可以看看当时我发的帖子
% _/ b- [# D& [$ Rhttp://www.stemcell8.cn/thread-35845-1-1.html
3 }. s& {0 ~: H* m9 z$ x5 {6 e; L现在我已设计了鼠与牛302a，302b，302c，302d，367，499a，34c的引物。

kaxdd

回复 runsong 的帖子! \( W2 ?: O2 V& t' u: A* N" a% L

  o) V/ O8 k% H' a- W& K8 g7 _4 p我只是想鉴定一下细胞内是否有某一miRNA的表达，不用定量，是不是只做RT-PCR就可以。

runsong

回复 kaxdd 的帖子- D4 A; D6 u! Y7 v8 V7 A
/ y- c. W7 ^% G+ g+ y4 ?
可以，但要摸索循环数，我感觉同一miRNA在各个样品中的表达并没有质的区别，只有量的差别。

wolf1978

runsong 发表于 2011-7-11 23:00
2 u2 \& r5 }7 g# i回复 kaxdd 的帖子" Z8 G4 e  S  J$ u$ S* g
; W3 e0 D0 G- J0 T
可以，但要摸索循环数，我感觉同一miRNA在各个样品中的表达并没有质的区别，只有量的差 ...

! J" p- Q+ M2 l, X' n* C- p同意，以RT-PCR的敏感性，含量很低都能够扩增出来的。因此对自己关心的体系最好有个参照，以达到相对定量判断的目的！