qRT-PCR结果分析

mansnoopy

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" k  b" ^+ Z# J, q4 H/ t$ J
首先需要realtime的实验重复。如果还是不行的话，你可以重新抽提RNA，反转录。

lvmaoshiwo

回复 sj03572001 的帖子
0 w+ z& Z+ }, T9 M
  O7 ]+ J7 O- Q. |定量PCR确实纠结，我做mIRNA的定量重复性不高，一会上调一会下调，肿么办啊~！

frankieisme

q-PCR的结果肯定比普通PCR的结果靠谱,重现性也要好.你的问题可能是操作or机器的问题.溶解曲线好不好只能说明你的产物的特异性,具体量的差异还得看Ct值.你确定做的是绝对定量?一般实验室的qPCR都做不到决定定量,首先是需要Taqman探针,再者需要构建质粒,根据质粒的copy数绝对定量.

safflower

谢谢！

safflower

谢谢！

sdjjfangfang

回复 safflower 的帖子' E- ]! \* b" Q6 o* d# h0 U

7 r! X5 h! j7 V7 k7 j对于Real Time PCR，你要确定你的对比基因的GAPDH差异不是很大，要不然GAPDH差异过大，会造成分析数据的不准确。
% A8 g6 i$ k1 c8 S2 P对于单纯的电泳，首先要看低循环数下GAPDH是否一致，如果循环数过多，会掩盖GAPDH之间的差异。其次要看你的目的条带的循环数，如果循环数过多也会掩盖真实的基因表达情况。
" F  K0 y$ r4 M2 ^一般Real Time PCR的循环数都较多，如果是用Real Time PCR的产物进行电泳的话，结果一般会一样。但是一般不建议用该产物进行电泳，因为同普通的电泳相比，程序是不一样的。而且Real Time PCR的分析结果显示的是初始细胞中基因RNA的表达情况，而电泳结果则显示的是体外循环之后的结果。
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safflower

OK，thank you！

希望之光

哎!一定要注意个人操作！建议你去看看关于如何做好Qpcr的相关资料，要尽可能的降低主观因素带来的影响！降低由试管效应带来的误差。

刘艳85

加样的过程，注意些加样的细节吧，毕竟每一种的加样量很少啊。不知道你们做real time-PCR的终体积是多少啊？还有，建议样本最好放在仪器的正中央。跑电泳时，建议加样量取相同的值，以免有的多，有的少，影响实验结果。

2006dulifang

回复 frankieisme 的帖子3 S* u/ A' c; f* I- g3 i

( d7 z3 P8 v/ |1 T# p3 y) Y根据质粒作为标准合适吗？质粒的扩增效率比较高，结果不见得可行。我试过用基因组作标准和质粒作标准，从结果看用基因组比较可靠。