请教hESC的冷冻与解冻protocal,急急急急急急

qiushuiwuhen

如题，请教各位战友关于HESC的冷冻protocal,之前的冷冻用的是10%DMSO+40%SR+50%培养基，问题是：解冻后的克隆几乎全部死掉，不管是在feederfree还是feeder-dependent的情况下，长势均不良好，请教各位冷冻解冻的经验，如能分享protocal更不胜感激。

希望之光

我都是用2X的，就是2ml的DMSO, 6ml的KSR，2ml的DF12。细胞离心后，用培养液以适量体积重悬，之后等体积滴加冻存液。用程序冻存盒冻细胞，第二天移入液氮。如果还不行的话，就在冻存液里加点Y27632，我不加也没事的。复苏常规操作就好了（越快越好）。

希望之光

我都是用2X的，就是2ml的DMSO, 6ml的KSR，2ml的DF12。细胞离心后，用培养液以适量体积重悬，之后等体积滴加冻存液。用程序冻存盒冻细胞，第二天移入液氮。如果还不行的话，就在冻存液里加点Y27632，我不加也没事的。复苏常规操作就好了（越快越好）。

xuyang0317

整个操作流程要快，细胞复苏的水温/时间，都是要注意的，控制好，细胞死亡要么是你复苏的过程不好，要么就是有些有害的液体没除尽，之前的HESC能够培养出来到冻存说明的使用的培养基应该是没问题的，找找其他的原因！
  Z% T4 M8 m0 o1 k这个各方面都要考虑到，而不是一个面！

qiushuiwuhen

回复 希望之光 的帖子5 t- Q( `. e% k  C3 `

& e- n6 T; s0 A+ v我算了下，你的比例大概是DMSO：SR：培养基比例是：1:4:5的比例，那副速率高吗，复苏完一般多久能存活，谢谢

qiushuiwuhen

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我算了下，你的比例大概是DMSO：SR：培养基比例是：1:4:5的比例，那副速率高吗，复苏完一般多久能存活，谢谢

qiushuiwuhen

回复 xuyang0317 的帖子7 j  P# t, U1 R! `
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能否请教你冷冻液的配比是多少，细胞的复苏率高吗，另外冷冻液中HES培养基是否还需要加bFGF?谢谢

星光灿烂

我用的也是2X的冻存液，20%的hES培养基，60%的FBS，20%的DMSO。细胞低于800转离心，用hES培养基重悬，加入等体积冻存液。分装冻存管，每管的细胞量要多一点，2-3个孔的六孔板的细胞冻存一管，冻存液的体积要在1ml左右，如果冻存液体积较少的话对细胞的损伤会较大，第一天放-80度过夜，第二天移入液氮。复苏速度要快一点，融化后直接十倍稀释在离心，复苏效率还可以。

星光灿烂

我配制冻存液用的hES培养基就是平时培养时用的培养基，里面加了bFGF。

qiushuiwuhen

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/ M& q( \  }3 S! ^. |十分感谢