关于CFU，成集落培养的问题

洛古16

请问，各位大神，0 ~0 W9 X" Z7 o3 C: c
1、脐带间充质干细胞能进行甲基纤维素的成集落培养嘛？
$ q. w1 C3 p% ^' @2、成品的甲基纤维素培养基100ml，一般分装多少ml一管呀？

子非鱼

脐带间充质干细胞的集落应该是用液体培养基吧。成品的甲基纤维素培养基的分装的话，考虑种植时的损耗就分1ml一管，不考虑就可以分900ul一管。

洛古16

回复 子非鱼 的帖子1 z! ^( a# D" w

' v* V% W- s, E! w  o甲基纤维素的培养基只能用来检测造血干细胞，祖细胞的分化潜能么？- s& [) F; {( E9 [) S
培养当中的二倍培养，三倍培养是什么意思呢？2 |" j4 }$ c! {* I) \
还望不吝赐教啊，谢谢

子非鱼

你现在是不是有一瓶甲基纤维素的培养基的体系啊？B cell的集落培养体系好像也是甲基纤维素的培养基，但是当时因为一些原因，我没有认真看产品的资料，所以也不确定。但是我们用的甲基纤维素的培养体系中有长出过间充质干细胞，但是不是聚集状的，所以间充质干细胞的集落应该是不行的。
& o5 l; \6 U; Y7 X" o. a: }你说的二倍培养，三倍培养是集落培养中的吗？我没有听过，只知道原代集落的二次铺板。0 @8 Y3 s4 I, x8 ]
我是个渣渣，所以很多了解的都不全面。

jjjddf

我们分装一般是十五毫升，但是要看你的使用量来算

洛古16

回复 子非鱼 的帖子! x" x6 d$ S. ?+ Q+ V
+ @6 Z. f; d+ ]- s
有，STEMCELL的含有因子，木有EPO的培养基。
: f! T' {3 _: W0 k" W0 ?那，原代集落的二次铺板是怎么操作法呀？
4 l% \% o- c3 d: ^& D; U- X刚涉及成集落培养，看那个说明书好多都不认识。

子非鱼

我主要也是做的造血干细胞的集落。
$ Z/ K  T' K& D; W4 E我贴一下我在书上看到的集落重铺的内容，因为书上是讲自己配集落体系的情况，所以你斟酌着看吧。
! h/ v  q( y, R) y( t: A) _8 U集落重铺$ z% r" v% y0 m( `, u% q6 Y1 r
    注意：该技术只适用于使用甲基纤维素培养的原代细胞。琼脂培养基过于坚硬，极其难将其中的集落挑出进行二次铺板培养。若要将CFU-GM的原代集落进行二次铺板培养，只需将琼脂替换为甲基纤维素，并将2×McCoys替换为IMDM。
! Q" y2 {; ]! n9 G4 U9 y  v; X材料/试剂
( V$ C& i: ~5 j" Z3 T+ s除非特别说明，所有材料均需灭菌# t) j" s" H+ b; g
(1)        带通风设备的超净台
9 r0 \9 [, X7 Z" e  Y6 r% G% L(2)        倒置显微镜/ q. x# q8 H$ B/ C, W& e
(3)        20ul微量移液器: ], ?' x9 a: N0 l
(4)        含青霉素/链霉素的IMDM
: @; s( F9 O: {' b8 B6 [, {(5)        12mm×75mm聚丙烯试管
& Q! l8 F; O0 K1 d: |9 X收集集落步骤0 Q4 d9 P1 J$ n# ~6 `
所有步骤均需无菌操作。# r; p& e9 d6 Q0 Y; s' R  {% o0 P; g7 u
(1)        确定需要进行二次培养的集落数目。每个集落准备一只试管，加入100ul含有2%FBS的IMDM，拧紧盖子。
' P! o$ P7 X+ U(2)        将显微镜放置在有通风设备的超净台中。
& R+ {4 v1 s. ~4 P2 e, G(3)        将含有待收集集落的平板置于显微镜的载物台上，固定平皿并移去平皿盖。
* l2 j2 R. [# T; w& y; K9 c(4)        如果显微镜没有配置平皿固定装置，可将胶带的黏面向外环成一个圆圈，将两个这样的圆圈粘在载物台上，将平皿置于其上，同样能达到固定的目的。
% ]- ^7 d4 A: T: a$ U(5)        找到目的集落后，用20ul移液器轻轻吸出集落。
' B+ v7 X, U9 F(6)        单独存在的集落最容易收集。  K% h2 t$ M8 r$ u! m
(7)        将集落转移到（准备好的）含100ulIMDM培养基的试管中，吹吸数次以清洗吸头。  X; D$ D0 H  w6 _& I7 M2 ^
(8)        集落收集完毕后，进行铺板操作。! ]$ i# a* y5 s* i' }* d3 t- t2 e- \
集落收集后的铺板步骤
& y# X, z* t' R# l6 m6 G所有步骤均需无菌操作
/ n* d6 a5 @/ r8 j$ G( [+ R(1)        计算收集到的集落数，按每个集落1.1ml的量准备培养基混合液（包括甲基纤维素），静置使气泡溢出。, F6 d4 ~2 c0 R' Q5 X7 X
例如，如果你从含有IL-3、Epo和SCF等生长因子的平皿中收集了100个集落，那么就准备110ml培养液，所用生长因子与原始平皿中的相同，并在加入细胞之前加入甲基纤维素。
) ]0 i1 w. N$ v3 ~# d(2)        当培养液澄清后，用配用16口径（gauge）针头的3～10ml注射器，向每个已含有收集到的集落的试管中加入1ml，振荡混匀。
8 c8 O1 B/ c: q+ }; O(3)        静置。
2 B5 \3 g. t4 M1 d, j(4)        将上述混合液倒入新的35mm平皿中，转动使液体覆盖平皿。6 m1 V5 N/ |  l; ~0 C( Z- j
甲基纤维素比较黏稠，总会有培养液残留在试管中，因此不能100%重铺所有集落中的细胞。如果你的实验需要定量计算最后的结果，可以加入一定比例的培养基混合液，通过矫正计算进行统计。例如，加入1.1ml（1ml培养基+0.1ml收集的集落）培养基混合液中的0.9ml，所得的二代集落数则大致代表了全部集落中82%的集落生成细胞。8 `4 t  H! Y" W, F
(5)将平皿放在37℃、5%CO2/O2的湿润环境中培养14d.
# J; o, E0 {, {2 r* G) J

洛古16

回复 子非鱼 的帖子8 A9 ^7 P" K1 z* F; w' g% C
, @1 R3 T2 P/ O, W9 W  f
哈~~~非常感谢

洛古16

回复 jjjddf 的帖子) I2 @  m+ s! J" V

3 m: n4 |( L; ~. y15ml啊，那用什么分装呀，注射器还是吸量管啊

jjjddf

回复 洛古16 的帖子+ x; t8 G( N5 e# u% A9 F0 s

# ^" D* Z2 C0 y/ p4 q" ~我们用的是吸量管