|
- 积分
- 19
- 威望
- 19
- 包包
- 471
|
我主要也是做的造血干细胞的集落。# o# g ]$ v$ N- \: A; A
我贴一下我在书上看到的集落重铺的内容，因为书上是讲自己配集落体系的情况，所以你斟酌着看吧。
( U* o( q" |. l+ _0 `) A集落重铺3 z1 a0 }# t( c6 l! P
注意：该技术只适用于使用甲基纤维素培养的原代细胞。琼脂培养基过于坚硬，极其难将其中的集落挑出进行二次铺板培养。若要将CFU-GM的原代集落进行二次铺板培养，只需将琼脂替换为甲基纤维素，并将2×McCoys替换为IMDM。0 l1 X/ w2 g f; v9 g/ Y
材料/试剂
- u, ?8 n7 e6 o* E除非特别说明，所有材料均需灭菌) b5 p5 l* X/ j ?% y0 R
(1) 带通风设备的超净台
0 f0 I6 w' `! ]) }( y(2) 倒置显微镜
u% l( F% c' j(3) 20ul微量移液器
4 J$ L8 c* z4 M( R. u! w' W* ]7 q(4) 含青霉素/链霉素的IMDM5 {4 P5 {7 G9 ?1 y& F
(5) 12mm×75mm聚丙烯试管0 R* x) V3 f$ B( h
收集集落步骤
. W4 y) s$ _9 [2 Z+ G所有步骤均需无菌操作。3 o: G7 V% F1 x# m! ?2 T0 V. E
(1) 确定需要进行二次培养的集落数目。每个集落准备一只试管，加入100ul含有2%FBS的IMDM，拧紧盖子。
' S) J! p) [; n# H( r" ]' D8 z4 @(2) 将显微镜放置在有通风设备的超净台中。
, ~0 U% H& |1 I0 r(3) 将含有待收集集落的平板置于显微镜的载物台上，固定平皿并移去平皿盖。
+ T2 V& ~) |4 B+ ]9 }* C- Q+ M(4) 如果显微镜没有配置平皿固定装置，可将胶带的黏面向外环成一个圆圈，将两个这样的圆圈粘在载物台上，将平皿置于其上，同样能达到固定的目的。
3 r$ A" n; q/ f$ D5 A(5) 找到目的集落后，用20ul移液器轻轻吸出集落。" Y i$ c4 U% k ^" H. j5 R0 w! o
(6) 单独存在的集落最容易收集。
4 ]7 P. D# l; z$ }7 U8 ^9 G- k# C8 W- @(7) 将集落转移到（准备好的）含100ulIMDM培养基的试管中，吹吸数次以清洗吸头。 N$ x# O( b7 u8 o$ U/ a. |) Q
(8) 集落收集完毕后，进行铺板操作。& z) `; ]3 R5 P9 Q5 Z8 ?
集落收集后的铺板步骤- r( d3 {% e6 m% \, T% A+ |
所有步骤均需无菌操作6 S8 T+ }1 L& L
(1) 计算收集到的集落数，按每个集落1.1ml的量准备培养基混合液（包括甲基纤维素），静置使气泡溢出。
" ]$ V# r$ U4 \: Z2 Z# I例如，如果你从含有IL-3、Epo和SCF等生长因子的平皿中收集了100个集落，那么就准备110ml培养液，所用生长因子与原始平皿中的相同，并在加入细胞之前加入甲基纤维素。
; {7 ~: R! \% I; ]6 y. ]( \& b7 z(2) 当培养液澄清后，用配用16口径（gauge）针头的3～10ml注射器，向每个已含有收集到的集落的试管中加入1ml，振荡混匀。4 S" E2 ` D1 _/ I
(3) 静置。
" h+ I+ U* C' k4 e" h- @& R1 o( n(4) 将上述混合液倒入新的35mm平皿中，转动使液体覆盖平皿。& Q. |1 r# [5 N+ p, f; [+ L% N1 I# f
甲基纤维素比较黏稠，总会有培养液残留在试管中，因此不能100%重铺所有集落中的细胞。如果你的实验需要定量计算最后的结果，可以加入一定比例的培养基混合液，通过矫正计算进行统计。例如，加入1.1ml（1ml培养基+0.1ml收集的集落）培养基混合液中的0.9ml，所得的二代集落数则大致代表了全部集落中82%的集落生成细胞。" Y. {8 V+ r6 k" a! ?. G
(5)将平皿放在37℃、5%CO2/O2的湿润环境中培养14d.
0 f8 w2 ]0 W) i* h/ n |
-
总评分: 威望 + 2
包包 + 10
查看全部评分
|
发表于 2014-7-21 13:57
