干细胞的复苏与冻存如何操作？

kate8801

1 O, C  L- d% Y2 f9 v

* ?9 w+ k9 c* X& ?% `（1）准备 37°C 水浴和预热到 37°C的完全培养液；准备好一个15mL离心管，同时加入9mL的完全培养液；
) B5 q- P+ v8 o4 g; ~  e$ d  s$ f- a（2）准备好这些后，将细胞从液氮中取出，放入到水浴锅中，同时轻轻摇动，保证细胞能够在2min内完全溶解，同时应该注意不要把冻存管的管口没入水浴中（可能由水引起污染）；/ l1 S. B" g4 Q/ y# \
（3）溶解完全的细胞要快速转移到无菌超净台中，用75％酒精棉球擦外表面。用吸管将冻存管中细胞悬液吸到15mL的含有培养液的离心管中，同时用培养液洗2次冻存管，一起加到离心管中吹匀，避免产生泡沫；
- t, w8 [% \/ ~（4）250 g 离心 5 min；弃上清液，加入2-3mL预热的完全培养液，轻轻吹匀，保证细胞完全重悬；
& c% b) e5 c$ W3 `, {- o- e（5）将重悬的细胞接种到T25或者是T75的培养瓶中，加入适量的培养液，再把细胞摇均匀，放入37°C 、5% CO2 培养箱中；
& o3 b. E( }0 k! \! m（6）第二天进行换液，保证去除死细胞。正常的培养过程是三天进行一次换液，如果细胞长到有80-90％汇合进行传代。
% }4 C+ V6 j. Y0 z$ A6 h细胞冻存：将冻存管放入冻存盒里，再放入-80℃过夜，由于聚氯乙烯导热比较慢，所以温度可慢慢降下来，次日可直接放入液氮罐。- W3 ?0 E' u  s" v& f

子非鱼

细胞水浴解冻的时候可以在还有一点点冰块的时候就转移到无菌超净台，不需要溶解完全。

元杰5

请问你复苏的是什么类型的细胞？我们的复苏方法不太一样：准备37°C 水浴，准备4°C预冷的生理盐水或培养基，复苏时注意复苏终点是肉眼可见的小冰块完全溶解的一下。后面洗的步骤基本一致。6 q+ I5 V) P* Q. L% ]* D
至于冻存，-80℃过夜没问题，我们常用的是程序降温仪

hefan1234

步骤2中，冻存液不要完全融化，到即将完全融化为佳；步骤3中，最好先将细胞转移到新离心管中，缓慢滴加培养基来稀释冻存液，防止渗透压骤变损伤细胞。

woshibotao_01

复苏最好在一分钟内融化。& R0 F9 ^) Y+ O( v* C: q5 }* s0 L: h7 {
还有想说的一点就是复苏时一定带好防护面具和手套，避免由于冻存管爆炸引起的受伤。

2014052

冻存细胞，最后都是要放到液氮罐里面的，人家说如果液氮中有支原体的话，那么冻存的细胞也会被支原体污染，请问大家怎么看？盼回复讨论

细胞海洋

回复 2014052 的帖子2 ]: ]' U/ P  G# e) I) w, z1 l' @

. V# q8 ]1 Q1 Q: ?. C  R0 @+ J建议你发新帖提问

chuanbaozang

另外，你放在简易程序降温盒里直接放到-80℃进行冷冻，不是因为盒子是聚氯乙烯的缘故，是因为盒子中有有机溶液，比如异丙醇等，可以在降温过程中产生一个缓慢的降温曲线，基本满足降温和冷冻的需要。
- V5 w  P: V! z$ H' L  b

colins

现在有不加有机溶剂的盒子，更安全啊

zjhzxp926

冻存的细胞放在程序降温盒里再放入零下80度冰箱就可以了
6 S5 j  C7 p# r) H$ n复苏的时候要快，注意复苏的时候要戴好防护面罩，防止冻存管爆裂，毕竟安全第一嘛~