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本帖最后由 细胞海洋 于 2015-12-22 12:26 编辑
! B: L. m" D" q Q! h
; r- s# A ^3 D6 C$ T! A! k8 \有一个相关的，希望对你有帮助& Y/ L% M4 {! d% |1 J1 S! {
一、目的1 f& E& |1 G9 b7 N4 S4 U" n) j
2 S3 i5 k$ U1 ? X c8 @
MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。疾控中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程进行操作。) }* J. H; J) h9 w7 V8 N
. X$ X( ?/ c6 F2 c7 m' N: D3 \
二、适用范围
1 Y" H |0 v) v+ g* @, `7 \. \, u5 P" v( s
适用于疾控中心所有技术人员 。
4 Z' \" U$ m2 x- p6 @) F
- P7 S/ F7 h0 `: V1 Q三、程序
: t" ~$ l2 r9 t: u* |/ \. |$ a$ h- ~ v4 @& Z* W
（一）生物安全要求
0 S/ C0 Q1 H* ~4 ~$ j5 |2 a5 B9 I2 }7 X% Q3 K
实验室生物安全级别：BSL-1
5 r3 Q8 E9 s4 @
0 N1 u5 j0 L+ W! Y! M" E4 k所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。
& p" v9 O, H! s9 n* }! W5 r
! O* |% P, p/ e+ G) w（二）材料4 g# I0 @8 A8 y# b6 K0 V0 i7 o/ v
, [! n5 {: v+ {
1. 生长成片的MDCK细胞
3 Q3 t9 ^ o) Y) ^# e# V- m9 v0 x5 W0 o* K- {* D4 a% \. a
2. 无菌的T25细胞培养瓶6 V7 G4 V7 H3 F3 u Q
% f/ j3 a* n4 D% V* t
3. D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）2 P$ a7 V/ o" i6 B7 y
+ W- s! k# D* B- k2 L4. 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃
% n- F- ^ ]* v( x0 y; S( S
8 a# T0 l( j4 L* B2 t( w5. HEPES缓冲液，1M母液
: m' S M7 _+ K+ ]2 F9 \
$ _. q! |! U& K3 ]# a# D, Y6. 胎牛血清- R0 F( V8 o$ f( ~
; M9 t& a( }. n7. EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃, G: m$ }- K" D) z4 h
5 \- r9 f8 d4 w! k3 G
8. 7.5%牛血清白蛋白组分V, ?7 z1 w2 A- _: i( k9 f% `% V- \
' h' l- i4 `) F) M8 [. r
9. 1mL、10mL无菌移液管
# y* n) c5 i7 S" {: b* N/ p) E( d, X) O# V
10. 70％～75％的酒精5 M' d! D: G+ e! h, t; @4 `
# Z; G6 C! ?# E, A0 b) h3 Z4 _3 g注意事项：经常检查试剂使用的有效期。+ E2 V3 l0 {& F/ M; z9 W# g3 h
( ]) o6 Q9 @5 H- b# D
（三）实验步骤# @$ T! W& o+ K& s& h& B; Q
b; A, w- G9 |2 |这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。+ n3 Z4 T, v4 |; K' s5 m/ a
0 r# i5 J1 A$ K" W+ f1. D-MEM培养液的准备# i- w9 m7 W) X
3 L% F2 s* v& W& Z500mL D-MEM液中加入：
+ n: U9 @: {0 C& \+ u2 M/ _0 C: x' P" J1 e, t4 K2 A
青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素），
6 ~8 B9 w* b$ N! A4 k8 @
% Z U9 s6 l! A& sHEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。. d3 p0 v+ I- A! E: S
! j O4 ^; B; K; N0 ^4 u Z, g' g
7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL
a( v6 b' ?! Z* y
0 B K. _& k% a! b) ~) b2. 细胞生长液的准备: B& ^, |" ?' K( y
3 Z1 K# `$ e3 Y6 ^& _6 f S胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
8 S# q4 G% }1 l6 ?0 u
) j* C3 W& Q7 l, h3. 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
9 k8 F3 ?8 r' \& l
! I1 O, x r" x4 L1 y4. 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。" F! _' X3 K! l/ Y. I! O5 D; \9 k8 y( f
9 V7 }' Q/ b8 B5 J0 y) {
5. 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
T, L1 a% t: {' h5 ~" z
& D2 I0 |- f7 G' f4 e5 l6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。
# `! ^# Q7 D( I6 p7 J) H \6 ?& ]. e& X9 a& N, [
7. 加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。4 t- h- M* [0 Z( C0 U5 X
; j5 b( g( A. ~9 E
8. 取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）5 v, j/ V% o4 L) W6 @7 r' }
) U8 J9 |; T0 c& T7 g0 D }9. 每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。. G1 ] H9 a% a/ i( [- }2 I0 {: ?
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10. 于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。, ]) y2 ?4 u% u# X4 T; |
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发表于 2015-12-17 08:53
