神经球传代问题？？

lujn100

我的原代神经球好不容易养出来了，但传代总出问题，总吹不成单细胞，我的protocol基本如下：收集细胞培养液，1000r/min离心2-3min富集神经球，弃上清，加入tryple（胰酶的替代物，之前Nature protocol上提到过）37度消化7min，机械吹打60下左右，1ml和200ul的枪头都试过了，镜检看还是没吹散，后来用1ml注射器又吹打几十下，好不容易吹散了，接种后好多细胞都不聚球了，估计是损伤太大挂掉了，各位有没有好的传代方法啊？谢了~

wgydys

1.加入tryple前用PBS洗三次。' M9 h: x* Z% \1 [, x
2.细胞细胞打不散，可在tryple中加入2%EDTA,应该可以打散细胞，不要强力吹打。

zsc78

同意楼上意见：首先你没有用PBS或HBSS漂洗，培养液或血清中和胰酶的部分活性；个人经验好像胰酶+EDTA的消化液的消化能力比tryple强，tryple好像相对温和些。

lujn100

回复 3# zsc78 " c8 m, C+ k; B9 X
5 G! E6 {0 u# _8 ?. V5 ^

- N+ m# }) ~- X* u- r; T) N* w8 C    谢谢哦~
4 e3 Z/ z( t6 J: l# ?    我的培养基里是不加血清的，用你的方法大概需要消化多长时间呢？我用普通胰酶接种原代细胞时消化5min，发现细胞基本都贴壁了，分化出好多小胶质，是不是消化太厉害了，所以我现在都不敢用普通胰酶了....

lujn100

回复 2# wgydys
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: _5 s$ i, f$ A! N) [  c    用pbs反复洗，会不会对细胞损伤太大啊？而且我的培养基里都没有血清的，你在传代的时候一般吹多少下可以吹散啊？

wgydys

消化时间长短需要根据镜下观察决定，只要细胞间连接带明显可见和粗大即可，每种细胞的消化时间不一样。

get0715

回复 6# wgydys
1 n" O" b* ?2 @! }3 b  L
' e- q7 g# J1 c1 G( v7 m神经球不是贴壁细胞，看不见消化程度。如果细胞有突起贴壁，细胞很可能就已经分化了。

get0715

神经球的传代问题确实不太好解决，你根据自己的实验做一组消化时间的梯度实验吧，相同多的细胞，加入相同浓度的酶消化，1分钟为梯度，看哪种最容易消化为单细胞，并且活性好不容易贴壁分化。

guojingjing

回复 4# lujn100 5 O" L  g! Y7 E( c
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( Y6 W6 I- U, d8 _. O1 q
    神经干细胞还能分化出小胶质细胞？小胶质细胞不是起源于骨髓吗？在发育过程中从外周进入脑内的

luckydog

用0.025%的胰酶-EDTA消化神经球