u6启动子的问题

hndxws

最近做shRNA，用的是pBSU6质粒，接入shRNA时，采用的酶切位点是ApaI-gggcc/c。但在具体操作时，有的是用ApaI切过后，要把该位点变为顿末端，就是把ggcc去掉了，然后再连上shRNA，还有的是合成时直接合成了个粘末端的shRNA，直接连上去，这样两者的差别就是ApaI上的5个碱基ggccc。: c5 f7 T! I; z& Z3 D
有人说，U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G，这样好像第二种做法有点问题，不知到底是怎么样的？做过的同仁请给点意见，或提供点具体的操作资料。Thanks！

ambassador

  e: y4 |! c" _7 j3 e( p" d( P2 i  l+ y$ o/ w
你的这个问题具体怎么解决我不太清楚，不过你上面的“有人说，U6启动时有固定的转录起始位点”，这个不要亲信他人说法，看看这个文献，对你一定有帮助：8 J* D) B( G, x! x$ s
5 b& Z& T2 u5 b' k& y0 s
SURVEY AND SUMMARY Transcription by RNA polymerases I and III & X$ F8 ^' E* L* c
http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/28/6/1283, Z3 }# W( _2 R9 x: {

9 l2 K6 X6 b5 M( I* {+ [. S  [9 P8 d0 a# x. c* S1 u
希望解决问题后能分享给坛子上的宝宝。

hndxws

因为大体上大家都知道怎么回事，就是具体的实验操作设计细节很难找到。我参考一下，看看能不能找到具体的东西，找到了的话就再发到这里。请用pBSU6做过这个的同仁也来讨论一下,给点提示。

hndxws

做shRNA的paper很多，但是用pBS/U6的不是很多，就我目前查到的具体操作还是这两种。具体操作是：+ Q3 l( f  p+ Q7 b. b$ b
第一种，依次用ApaI、T4 polymerase（或Klenow酶），EcoRI（或其他酶）切割pBS/U6，ApaI是必须要选用的，最后一个酶可以随意选。合成的shRNA的5‘端应该设计成平端的，3’端是黏端的。. \! x+ E2 f1 ~: v
第二种，直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切，这样合成shRNA时，两端都应该设计成黏端的。0 z- O  a: c) P% C7 Q" Q1 g: z+ b# k, d
这两个操作的paper我都有看到，而且第一种方法的paper稍多点。但是两个方案哪个更好，没有具体的证据。我这次做这个时，开始没有注意到这个细节，设计的时候，按照的是第二个方案做的，因为第二个方案简单。如果在不知道U6promoter是否是精确起始转录时，先想到的肯定是第二种方案。
; F1 r4 [) {9 H, c8 w. G8 C等过一段时间，我做个转染，收个样看看是否第二种方案效率会受影响，就说明第一种方案是不是多此一举或者是必须要按第一种方案做。一切结论都是需要证据的。

hndxws

最近做了两次实验。用病毒介导shRNA转染细胞试了一下干扰效率，发现干扰效率还是很可以的，所以我觉得第二种方案对实验是没什么影响的，也就是说，可以直接用ApaI和EcoRI（可选其他的）双酶切接入shRNA。
; B* J( W% Q8 i- i  m! A! S& M所以就我看来，有的地方说“U6启动时有固定的转录起始位点，就是ApaI的第二个G”。这个说法应该质疑一下。9 ~% f& c- A2 _: x5 ^# J
至于第一种做法和第二种方案哪个好，我没对比过，至少第二个方案是没问题的。

runsong

你好，我想用pll3.7做shRNA，也是卡在如何确定U6启动子转录起点的问题上，不知到底需不需要在意这个问题，请赐教。

hughliang

回复 runsong 的帖子1 T0 a- \( y: o) U
+ P2 F; F$ t% ]; ^# [+ i" C
我用这个慢病毒的改型病毒做过shRNA的表达
- A7 z5 |/ J+ y1 H* k1 E6 o' Y+ l6 s
+ {% k: H4 X2 V! j1 u8 G同这篇帖子一样，也是双酶切后连入，证实有干扰效应。
8 I4 t  m9 c1 f$ u, W+ h/ S
9 \2 \, W: p2 D: b4 u  H官方Protocol也证实这一点：
4 K4 Y1 ~" S6 h* C5 L5 n% D9 A* d
* p3 {- K* \! V& Ihttp://web.mit.edu/jacks-lab/protocols/pll37cloning.htm7 ]/ H3 p% S/ S: M' S$ B

hughliang

; j3 X, ^  w" F  b* t! t" A5 J; m# }1 K- z. R5 {' b
在这里遇见很多做慢病毒表达shRNA的朋友，向大家请教一个问题：
  h3 V( \; ~6 s" B+ s- c/ h4 G1 i3 W% h8 H( t0 F
表达shRNA的慢病毒转染细胞系细胞，流式分选带荧光的转染细胞，培养，western blot证实了干扰效应。3 ~: P9 S4 ~+ |6 `; j4 M

1 y  H1 O  Q$ k0 [可是，培养数月后western发现干扰效应不再明显，甚至消失。在几株细胞系中都发现了类似情况。
( N( W" G. S( f. M+ T: x8 j, t
& E  D; O3 T" H0 h! @! f6 f- m: v向大家请教原因和克服的办法，先谢！5 E) V: f, S) e' C

fguw

回复 hughliang 的帖子
1 y: ?7 O- L* h: t' w5 a. u. H1 s" ?  W4 D6 @5 c3 V9 Y* ^3 _
可能是长时间后慢病毒失活了，所以，不再有KD，
; H$ `' [& p$ L7 E没有实验结果验证，猜的3 ^) N9 ^- Z& R5 k3 [
作普通转基因有类似问题，
2 \' ^# g+ y( y+ x2 h有问题，欢迎探讨

runsong

6 j( ]- Z0 o3 v- |2 H
% ^3 r+ S. S0 x8 p' `9 N9 R
回复 hughliang 的帖子: ?, g- T6 Y# S& c. {
" d7 F* j' m- h% n2 J. x# N
十分感谢，你提供的线索太有价值了。/ C! c# K1 i7 o) e. s% v5 e
即pll3.7中8 k/ s0 _+ h- r" a( r
An HpaI site leaves a blunt end prior to the –1 position in the promoter. The oligo design must incorporate a 5’ T in order to reconstitute the –1 nucleotide of U6./ D* H& b% a" ]; B
引物设计应为 Sense oligo: 5’T-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(81NC)-TTTTTTC
! m, O' ~6 t# {; d8 J而且这个方法与一篇中文文章的做法一样。
; B, ~$ t4 `5 e《Cdx2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定》（钱倩）