请教一个连接反应的问题

mckf111

最近在做双酶切 总是长不出克隆 设了各种对照 焦点最终落到连接和感受态两步上, p) p8 `2 l0 n9 O  b0 H' l# B+ c% o
感受态问题已解决2 Z8 M# a  \; t- ?/ Y# x, z4 q' F
关于连接 我突发奇想 在10ul的连接体系中取了5ul去跑胶 按照预期 连接成功应有1条 不成功则2条 我估计两样都有 那应该是3条
1 O( V& B9 }8 C- |+ ?可最终结果是——0条3 u& J7 t4 V% z3 |! n/ t7 p
哪位大牛能给我解释下
" e9 M/ n6 G4 t+ y4 TP.S.有师兄说 可能浓度太低 条带看不到 但我觉得不可能 因为我酶切-跑胶-回收之后 将质粒和目的基因各为5ul再次跑胶估测浓度 两者浓度相当 而且都很亮 那么 我做连接时取了8ul的目的基因和1ul的质粒 那么跑胶时应该分别是4ul和0.5ul 按照前述经验 不可能浓度淡到看不出条带 大家赞同不？？？

chochochocho

; {, S4 [7 ]. U* }2 y  x+ z7 _. R5 A( E7 x
我被你的问题弄糊涂了，你说你连接体系10ul，其中目的片段8ul，载体1ul。余下的1ul是连接酶么？不用加Buffer的么？？你用的是哪一种ligation kit啊？

mckf111

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& j) E" n; A% N7 H) \7 U
9 l  C, Y% p7 V( _2 r0 M我说了个大概 准确的是载体1ul；目的片段7.8ul；10×BUFFER 1ul；酶0.2ul，总共10ul。9 |- a: i: ?; h0 P. X8 u6 F
可能您会怀疑酶怎么这么少，因为我用的是fermentas的T4连接酶（和另一个帖子里仁兄说的一样），其为5u/ul，说明书上说20ul的体系只要用1个u，我的10ul体系加了0.2ul（相当于1u）应该还超量了。。。因为没有0.1ul的枪，没办法。。。

chochochocho

回复 mckf111 的帖子' ]- ~5 R1 M. E% H7 y9 o' f

* k, w$ N: I! y) z7 p6 x5 Y1 I你的目的片段用什么溶解的？如果是TE的话，换成MQ。DNA浓度不够的情况下，可以先做乙醇沉淀再连接，不要用大体积的DNA溶解液做链接体系，离子杂质很多，影响连接效果。frementas没用过。我通常取1ul（50-100ng）电泳，一般不会只有一条带，还会有一些小size的杂带，但目的片段与载体连接后的产物带最亮。想不通啊，你的DNA都哪儿去了呢？

mckf111

$ D$ H3 k% s" I5 r7 `- P" b

+ d- w5 E$ Y* g2 s. K回复 chochochocho 的帖子: `1 ?" E" s1 }5 t. m

9 _" Q+ ~; A; e3 P) o谢谢 目的片段用胶回收KIT 最后应该是Eluent溶解的 应该是Tris 那MQ是什么？! t4 K. u1 g: Z2 n/ D  j4 ^9 ~
但不管咋样 我加进去的DNA怎么都看不到呢 我很疑惑。。。

chochochocho

) ?! U& _0 w' t/ P& ]& x" B2 K
, t! l8 [- m2 G/ rMilli-Q water就是蒸馏水再0.22um过滤的那种，我不知道是叫灭菌水？还是去离子水？还是什么的。离子Buffer不适合大体积用来做连接体系的，达到总体积1/3就最大限度了。哦，你胶回收之后做了电泳检测了么？估计大概浓度多少？7.8ul是多少ng？

mckf111

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1 X2 v) J5 o; F: z5 Y' h( u/ R% @+ W3 o* [0 ^
原来是超纯水啊～～
9 x  \+ X$ k. _做了电泳啊 咱这分光计坏了 没具体去测 但用5ul跑出来 质粒和目的基因亮度相当 而且有一般内参那种亮度 我想浓度应该不会差的  Q4 `& r& a2 o# E& `1 x0 T
“离子Buffer不适合大体积用来做连接体系的，达到总体积1/3就最大限度了。”这句话我没太看明白 求详

chochochocho

哦，超纯水啊。如果你用离子溶液溶解的DNA，在做连接的时候你所加的DNA溶液要小于连接体系的1/3。: d0 E) T5 u# R
比如：连接体系9ul，那么DNA<3ul； 要是用超纯水溶解的，就没关系了，但是由于缺乏离子环境不能长时间保存DNA。

mckf111

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0 o3 a4 h% j0 Z9 X9 @  U3 a$ j9 J9 p- Y: i
那会不会导致因目的片段太少 连接产物过少啊 不说一般都要是质粒的3-10倍么。。。
3 T- I' }( a4 F- \, S! ?8 y另外 剩下来的体积是用ddH2O补齐么？看师兄们做的时候 都不加水的 把目的片段代替水猛加。。。

chochochocho

你们都是猛人结果可以么？不会变少的，你没明白我的意思，DNA量没有变，是被浓缩了。比如：500ng质量不变，体积从7.8ul到2ul。我从没用过ddH2O做过分子实验，都是用的MQ，不过我想都一样吧。