关于插入多克隆位点的问题

军医

) y; ]$ h7 F5 f5 {8 [0 _+ g
3 t% |" O) [$ y0 v我想在载体中插入一个有四个酶切位点的多克隆位点，用引物的形式合成了两条互补单链，留出了粘性末端，现在我把两条引物混合并95度10分钟，72度两分钟，再与酶切好的载体骨架用SolutionⅠ连接，这样做合适吗，请大家说说看法，谢谢了！

深海寂寞鱼

回复 军医 的帖子8 m" O" v" j% R5 B' F3 M: G0 W4 V! ~
/ j) \! L9 e3 p( l! L0 f5 D2 c7 p- w
to 军医：
* x, I" V5 u" X9 B, B4 \+ ?% j2 ^/ {) h: ~2 f1 J
    看来你的平末端化连接已经做好了。恭喜你啊。不知道连接处你有没有测序？
! }' j; x; X  G* E5 d. R- y) _5 r/ b9 M; \, M5 r/ c, P% |
    你列出的插入方案基本是可行。注意几点细节。, A: e% ~! A3 \* c
6 k- {# B' ~8 `2 D6 X
    1. 你退火时的buffer是什么？
; s0 M+ G' i. F% }. |& d# \
0 W2 j  {. Z1 x  B% l/ I2 J! `    2. 退火温度为什么选择72oC ？+ L! Y8 _9 y1 C# `# _

8 u8 V. \* M9 x% @    这两个问题是你此次实验成功的关键。% f! v1 p- D3 R1 h7 F8 P2 S
% {. ]0 @7 T9 l) F- l! C  v; S
     欢迎继续交流，共同进步。

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子& h# ]2 d3 L2 r) K1 _) T

( m9 j" L, A; b0 n9 a, \单酶切和双酶切鉴定正确，连接处测序了，结果还没回来呢。' Q9 S: x, c& y
退火时没加buffer，95度后再72度两分钟，再自然降温到室温，我想应该会形成双链吧，72度应该是Taq酶的延伸温度，直接降到室温就行吧。今天刚做的连接，明天转化看看效果。
" ~8 d& h2 F/ G$ d4 o& [8 Q6 T另外，我设计的多克隆位点只有3个酶切位点，23个碱基，这么短是不是不好连呀？

深海寂寞鱼

回复 军医 的帖子( }, `1 ]5 t5 m2 [/ ]5 w$ b; u

" G  x$ o/ ]7 ?! Rto 军医兄：
5 L2 ~; F5 t5 b$ a% E4 p  y) g8 j5 L8 y& B6 C
     不知道你昨天的转化效果如何？ 今天早上长的克隆多么？
6 n5 `  N2 [$ |5 a) ?, H; \8 s: E& I* y# X
     我个人的经验认为：, [. o- F) m2 _" y6 e3 j

( O8 ]8 `# _7 M  [. J     1. 需要用到退火buffer，这样形成的双链效率要稍微高一些。
+ K6 R& {) x: z8 R5 z- c& t( B  H! @. F5 G- o
     2. 不用经过72oC，就你说的72oC是Taq酶的延伸温度，退火过程没有Taq酶参与。* t1 Z6 Y" g! Q& {  _( |. R
- j/ E. U; z# E4 T
         所以可以不用72oC，直接缓慢降到室温就可以了。
+ g5 F& Y5 W8 O- N7 ^
3 S& j! `- C  @' ~' ]: o8 P3 D9 c. J         如果真有Taq酶参与的话，你的双链就会变成平末端了，反倒适得其反。" v/ q) S8 T5 P, e+ V. f( w( S- b

* M, d  f! V9 H     3. 控制载体和插入片段的摩尔比可以提高连接效率。; F$ E; s' V9 u  J: ~) q- a  O# H2 M

7 O& I: K  n5 s     4. 减少载体的量可以降低背景，也可以方便挑克隆。+ y6 _- U, G- ~1 O
* k' J+ s) g# ?1 A% J

/ `" O* N% ]4 H$ u4 Q5 H9 Q) [# r- K     总之，希望你实验顺顺利利。最好今天就直接成功。：）

军医

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, B( ?3 R# T' S$ @+ N8 w/ }+ r1 k, h( D0 b9 m/ ~
谢谢你的建议。今天长了8个克隆，明天提质粒鉴定一下。

深海寂寞鱼

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6 {" n( \2 p" ]" q8 a- M2 y! g0 M1 F* {+ i8 b1 o
呵呵  恭喜恭喜6 @# z: T/ r! c& l. Q6 s$ Q
) ~# y# m7 Z& {% \( q- X. Y; ]
静候佳音

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子* G$ g0 @/ t6 o, i( G; q4 j
: s# j) S) e- V0 d6 {
8个克隆有六个正确，下一步还要测个序，鉴定多克隆位点的插入方向。谢谢你的帮助！

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子- H  D" p4 o/ j3 a0 u% l

7 d+ M. M5 k' {* g; A  b我再问一下，我又在同样的位置插入一个98bp的多克隆位点，也是同样的步骤，连了4次都自连了，序列是这个F:CGCGCTCCGGAGATCTACTAGTGAATTCTCTAGAGTATACGATCGGATCCTTAAGGCGCCTCGAGCGGCCGCGGATCCCACGCGTTAATTAACCGGTA, p- S7 ]$ v" N4 t! e1 v5 x
R:CGCGCTCCGGAGATCTACTAGTGAATTCTCTAGAGTATACGATCGGATCCTTAAGGCGCCTCGAGCGGCCGCGGATCCCACGCGTTAATTAACCGGTA: z; M# U/ e* m. d$ b( o' i
是在MluⅠ这个酶切位点中插入，我怀疑是不是太长了二级结构比较复杂退火不易配对呀

a86856635

2 \5 x# {! H' o* x/ l7 l% S
3 N4 h) n! H5 T! E; ~
应该95度变性之后缓慢降至室温，我也做过，0.1度每秒完全没问题，根本不用72度。
7 f( z9 l/ S/ [" B' x* C. [+ f% R你插入片段的mole数比载体高很多，肯定能连上

a86856635

如果只在MluI一个位点插入肯定会载体自连，载体可以去磷酸化，插入片段要磷酸化处理，因为合成的引物5、端是没有磷酸基团的，其实磷酸激酶也不贵，但是片段太短的话回收可能有些低