细胞培养操作经验

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细胞培养操作经验3 I1 g7 d$ C5 Z1 I5 j$ |1 n: z
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1，注意无菌操作，配制培养液时尤为重要，并过滤除菌，实际上很多情况下生长不良是培养液的问题$ G6 g7 L# ?3 U7 j: t6 u
2，如果贴壁不好最好用多聚赖氨酸（生长基质）外理培养瓶. c" c! m- P/ ?. a$ U( v  h" L2 M
3，细胞种植密度不要太低，因为细胞与细胞之间会发出促进相互生存的生长因子
" u) W' P1 M: q, S, v8 z/ \4，注意及时更换培养液（培养液发黄，或者2-3天）& ^8 l& K' v+ k! R: D4 ?3 D
5，传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好，毕竟那又是另一种环境5 S3 N: Y" y. `, q: e6 ^
6，传代时先用少量培养液先培养3-5小时，然后再补足培养液，这样容易贴壁
) m' |7 c, v7 j; S" L& a6 \. h7，在养来之不易的细胞时，还是用一次性培养瓶为好，国产玻璃瓶实在不敢恭维，在这点上我有惨痛的教训。
* ^  n# [0 T: n! C* }5 ]8，细胞在新的环境里，初次传代时，最好对半换液，或1/3换液，让它有一个适应过程。
' A: w+ c0 q- C4 h, x: F9，我认为，glutamin很重要，培养基在4度中放置2周左右，Glutamin就会降解，所以新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin。否则细胞生长受到影响。2 s% D) G- a" F6 }
10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次。+ L  G! V6 u! y% R! z: a( k
11，贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,可能放置几天后颜色变紫.这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢钠导致了PH值的上升。你可以在使用之前松开瓶口，在CO2培养箱中孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的PH值(确定松开瓶口以保证气体交换)./ K; y; R3 f% O$ ~9 Y, K& g
12,如果细胞培养基偶然被冻,你应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以使用,如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基.
' v3 f* I/ o2 N& \) w4 z; @13，当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%,血清蛋白会结合和灭活一些抗生素.在无血清培养条件下，抗生素不被灭活.可能对于细胞达到毒性水平.8 k" x/ m: d/ @  t) [% |
14,一旦你在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,你应该在两到三周内使用它.因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解.
5 S& W' k- i+ I0 A6 [15，总之,大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀。将会影响它的性能。
% p0 J' x1 M3 b$ `% G$ c16,在进行传代培养时,我强烈推荐大家进行台盼蓝活性记数.操作者通常通过一个简单的稀释(1:4或1:2)进行传代,不进行活性检测,你可能接种比你认为的低的多的 浓度的细胞.这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长.
+ F, E& q# I# n, e& [0 K17，在溶解的一周内使用贮存在4°C冰箱中的液体胰蛋白酶在4°C就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变的不稳定。! z$ k" m( L9 `; R; j5 U* {# S5 d

" z0 M- x4 ?' T) q                              培养基血清浓度
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) Z7 u, I3 J4 s5 w5 J& t7 m   关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。, E; V: G# O) i* Y+ R

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  @: r9 S* A8 ^1 k                               污染的处理
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, X1 \! ~# A- v& f# e+ p污染现象：" N3 b' n" V5 q6 C
    细胞培养中的黑色小颗粒，高倍镜下可见活动，大多被细胞盖住，也有附着于细胞表面，消化传代较明显，一般几天内对细胞生长影响不大，培养液不浑浊，可以肯定是支原体污染。因其与细胞竞争营养，长时间对细胞生长有影响。
- s* m* ?' t' K2 \解决办法：
1 R" u4 |+ n8 a# M6 Q( H1、扔掉细胞
0 f+ S$ m( e% _* A/ g2、支原体不耐高温，55度5分钟，45度15~30分钟可干掉它，我试过55度，结果细胞也玩完了。要试此法就看你的细胞能否高温作业了
% E' J" J8 J0 L& T0 K) C3、支原体无细胞壁，许多抗生素无效。四环素、红霉素也许行，没试过
. k3 i4 b( K7 c( e4 c5 Q. w4、有战友说Tylosin（泰乐菌素 sigma）能行，没试过，准备试
0 T. F  v6 j3 B: V9 R5、M-Plasmocin （Invivogen），看了一下介绍，据说效果很好，晶美有卖，就是有点贵。
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2 \8 D5 d  c9 l6 Y5 N" U$ F" _" V培养箱的污染：一般与水无关，应该是过滤膜的问题！' j+ U2 }1 Z+ @  U7 R/ o
前提是水盘中应该在蒸馏水中加入硫酸铜，加量为饱和为止；+ M0 u: n9 v+ W, J8 x" H
具体可参考，培养箱的操作说明！！！！- I0 `3 V- S6 q8 h0 s
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ljs

这个是好东西

maomaoma

楼主总结得好，辛苦了！

xiangchou812

不知大家认同细胞操作经验中的第五条不，“传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好”。我0-90觉得等到长满了，细胞很容易就会开始老化，出现一些小的颗粒。长到超过90%就可以传代了吧？

franty

回复 xiangchou812 的帖子7 i/ g: U- k# b& \7 M
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同楼主一样，我的ADSC也很容易就老化，我一般在每隔24h观察细胞时，发现细胞长到80%时，再过24h看时细胞已长满，然后传代。不知道细胞从80%到90%再到长满需要多长时间，也许做个生长曲线能解决问题？

franty

第9条“新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin”，请教楼主，对于在4度放置超过2周的D/F12培养基要补充的Glutamin浓度？

luomeiwuhen

顶一个，谢谢！

dandan9230

细胞养着养着就会多一些颗粒，是老了吗？我遇到过，不知道是什么原因

mayuan3012

“10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次”
( u4 L0 \3 S% d* v0 S消化后细胞都起来了怎么用PBS洗呢？是要离心吗？