细胞培养操作经验

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细胞培养操作经验
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; m/ G+ Z" W9 \; J  a" ]1，注意无菌操作，配制培养液时尤为重要，并过滤除菌，实际上很多情况下生长不良是培养液的问题# s/ o/ N0 D+ m( N" g7 i  j, o! ?
2，如果贴壁不好最好用多聚赖氨酸（生长基质）外理培养瓶
1 G& H7 k+ s- g, u* z1 _/ ^( A3，细胞种植密度不要太低，因为细胞与细胞之间会发出促进相互生存的生长因子
& X4 D' b# o) ?1 m  u2 r4 p, E3 e4，注意及时更换培养液（培养液发黄，或者2-3天）8 M& N( h; O+ K5 ^  V
5，传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好，毕竟那又是另一种环境' \' D  }/ w5 K, p8 C6 O6 n0 s
6，传代时先用少量培养液先培养3-5小时，然后再补足培养液，这样容易贴壁
5 J) ?; S  M& {, s" B/ L' N7，在养来之不易的细胞时，还是用一次性培养瓶为好，国产玻璃瓶实在不敢恭维，在这点上我有惨痛的教训。
$ D1 h; d! _2 O; I+ G% ]8，细胞在新的环境里，初次传代时，最好对半换液，或1/3换液，让它有一个适应过程。5 X3 x0 s! B, O3 N2 ^' V6 y( L
9，我认为，glutamin很重要，培养基在4度中放置2周左右，Glutamin就会降解，所以新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin。否则细胞生长受到影响。
5 e) \0 i! M; ]0 V; s2 \10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次。
' T! T" K$ t+ W% n$ J11，贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,可能放置几天后颜色变紫.这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢钠导致了PH值的上升。你可以在使用之前松开瓶口，在CO2培养箱中孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的PH值(确定松开瓶口以保证气体交换).
9 o2 j" M2 x/ Q4 L5 _- p12,如果细胞培养基偶然被冻,你应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以使用,如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基.
5 B7 B. [# }) t$ r" `9 F( R13，当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%,血清蛋白会结合和灭活一些抗生素.在无血清培养条件下，抗生素不被灭活.可能对于细胞达到毒性水平.
( N$ W# s. N0 Z1 o# L; a14,一旦你在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,你应该在两到三周内使用它.因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解.
& X) Q! N; Z$ P5 ?, M: q3 V1 w- ^15，总之,大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀。将会影响它的性能。
: r& z/ F0 M/ n7 H0 }/ s8 F; b16,在进行传代培养时,我强烈推荐大家进行台盼蓝活性记数.操作者通常通过一个简单的稀释(1:4或1:2)进行传代,不进行活性检测,你可能接种比你认为的低的多的 浓度的细胞.这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长.0 o8 E1 u! q5 z! ]8 ?% }6 @
17，在溶解的一周内使用贮存在4°C冰箱中的液体胰蛋白酶在4°C就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变的不稳定。
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                              培养基血清浓度2 k  ?8 c9 g: q5 }
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   关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。& L6 f3 v7 m, {8 ?: X. K( E

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  W- Q; e5 Z4 ]3 Q3 D                               污染的处理8 b7 U5 K; }" y/ N. I+ \5 }, v
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污染现象：
/ v; N2 D/ c' x4 O. Z4 I. T* v( ?    细胞培养中的黑色小颗粒，高倍镜下可见活动，大多被细胞盖住，也有附着于细胞表面，消化传代较明显，一般几天内对细胞生长影响不大，培养液不浑浊，可以肯定是支原体污染。因其与细胞竞争营养，长时间对细胞生长有影响。
1 y4 p6 j  ~" q4 v, @( N. @解决办法：
3 n6 g7 ?/ ~  g+ I4 I( W' ?1、扔掉细胞6 k* ~! Z8 l. H( B  g2 I" o0 P2 {
2、支原体不耐高温，55度5分钟，45度15~30分钟可干掉它，我试过55度，结果细胞也玩完了。要试此法就看你的细胞能否高温作业了
8 [8 @4 M8 i/ }0 v4 e% z7 I3、支原体无细胞壁，许多抗生素无效。四环素、红霉素也许行，没试过2 O) M+ j1 B+ e" y
4、有战友说Tylosin（泰乐菌素 sigma）能行，没试过，准备试
$ e/ P( r2 B1 T' s* Q1 ]5 f! m" G5、M-Plasmocin （Invivogen），看了一下介绍，据说效果很好，晶美有卖，就是有点贵。7 I0 Q/ ~4 I9 Y' b3 k. `

/ b  ~* `! l+ R. v2 F# [培养箱的污染：一般与水无关，应该是过滤膜的问题！, |5 U* @7 a% X* m* p
前提是水盘中应该在蒸馏水中加入硫酸铜，加量为饱和为止；1 ~. X/ x% H( F! @% X
具体可参考，培养箱的操作说明！！！！
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hub12333

回10楼，我的经验是用血清终止消化后，离心，再用PBS混匀，再离心，这样就可以了

琛儿326

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( X, u+ h  b! z3 L( Z7 H/ J5 D: Y$ ]0 q# T1 L8 L) \
应该是离心后，用PBS重悬细胞，再离心一次

cypan

不错，谢谢分享

mayuan3012

“10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次”8 r7 _* j" H' N! O
消化后细胞都起来了怎么用PBS洗呢？是要离心吗？

dandan9230

细胞养着养着就会多一些颗粒，是老了吗？我遇到过，不知道是什么原因

luomeiwuhen

顶一个，谢谢！

franty

第9条“新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin”，请教楼主，对于在4度放置超过2周的D/F12培养基要补充的Glutamin浓度？

franty

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+ s5 ]: }* l  J0 b同楼主一样，我的ADSC也很容易就老化，我一般在每隔24h观察细胞时，发现细胞长到80%时，再过24h看时细胞已长满，然后传代。不知道细胞从80%到90%再到长满需要多长时间，也许做个生长曲线能解决问题？