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fwyou

想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

linlicau

fwyou 发表于 2011-8-1 21:15
2 H7 Z* A: J2 I6 M想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

$ j2 J& i! |8 r; K0 D9 n* i
什么叫扩增效率？, j, p$ {  _9 v1 a0 g

* n4 p6 n, d, |/ F7 }在做qPCR是要先test你的qPCR引物，看其是否特异。也就是在对照组（加水）和实验组中（一般每组3个重复即可。）先test一下引物，看峰是否单一，C（t）值是否合适（如果此值在实验组中为35以上，要么说明引物扩增效率不好，要么说明此基因表达量很低。）。对照组水中的C（t）值应该为N/A，或者在38以上为好。

johnnymmzhrt

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3 E) w; @& u; m( {, \! r/ H: S% V+ G" f* r& B# P: C0 k. U
你是要评估引物的效率还是别的什么？如果是引物效率的话一般三到四个重复就可以了% u) C' [4 M, a7 K/ {
但是貌似扩增效率这个东西很难评估的吧 不同的引物 不同的模板 不同的缓冲液配比都不一样 甚至连不同仪器之间都会有差别的吧。。。

fwyou

呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！; P$ n  [) T7 Y9 B
每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？
. W: c- u; f0 n# U5 S6 v1 y- D. f8 D  O0 v
谢谢啊

fwyou

回复 linlicau 的帖子: z: \3 e0 ]" v9 b* ~0 o; C- A
( f/ v6 b. V  y" D+ C
呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！9 h3 \# @7 A8 A. s
每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？! m; Z+ a) F4 [: n  o9 O4 B8 @" y% [

! e) @" ^4 U" J4 ^: d8 R  L谢谢啊

fwyou

对了 模板还做梯度稀释吗？

linlicau

% }. C- `+ e3 I

fwyou 发表于 2011-8-1 23:58 . x, f# y* G/ s! J$ N
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: S2 D8 N9 q1 B8 ?
: K; x" s6 v0 Z呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个 ...

/ Q( L  e" R" e- C
3 w; ~( L- J* d4 y; E
同学，可能是我没有说清楚。我再详细说一次吧。2 x4 A. M: H4 D: ]+ H9 Y" o" X5 q6 d

  a6 @, f" u6 @8 z# }1 y* S在真正的用qPCR做基因表达检测前，需要对用于检测该基因的引物进行测试，测试的目的主要是看此引物是否特异（特异的意思就是只能PCR出你要的基因中的片段，而不是其他基因中的片段），3 j1 P' ^+ O# ~& f
& ]8 d& X6 F7 V4 ]( H" r& }- t6 D$ e
特异的检测标准一般就是：你做两个组，一个是水空白对照组，即：其他成分加的都一样，只是template只加水，三个重复即可；另一组是实验组，也就是template加入的是应该包含你需要检测基因的cDNA, 三个重复即可。是不是特异就看：加水的组本应该没有检测到任何的表达，C(t)值应为N/A；而实验组应该有表达，并且你在看melting curve的时候应该是单峰，没有别的偏峰。且最好实验组的表达的C(t)值应该在35以下。然后，等realtime PCR做完，最好跑个gel验证一下，是否实验组只有一条带，且这条带的大小应该与你设计的大小一样，比如200bp（一般realtime PCR片段长度为100-300bp）。
% C7 Y# O  T: Z+ P
. q4 p( P2 }0 _6 }4 [如果这些都ok了，那么你就可以做你自己的实验了。
2 b1 C" U* D+ m& e5 A1 R
; }! f2 t( y* K3 W% G在做你自己的实验检测某个基因表达情况时，最好每个样品做三个重复，并且同时要做ACTIN或者GAPDH作为reference，最后要对通过实验组对这些reference基因normalize之后得到你要的相对表达值。你就可以看到在不同组织或者不同时间你的基因的表达情况。

fwyou

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* ?1 E+ B1 \+ ?
非常感谢 。。。。

echowdk

回复 fwyou 的帖子& o) `- D- m% d  @7 y7 X3 d
2 h( A# x- l; A5 B6 m8 W. S
在检测引物的扩增效率时，所用模板是需要稀释的。我们实验室一般是做四个梯度，4倍、4倍的稀释，即：1、1/4、1/16、1/64。

mansnoopy

我们一般是复孔3个，然后整个实验重复三次