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fwyou

想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

mansnoopy

我们一般是复孔3个，然后整个实验重复三次

echowdk

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2 n8 y: F. X3 g- P7 `4 }( O. K( y
/ y0 ]4 y2 ?: D" p: m" J2 d在检测引物的扩增效率时，所用模板是需要稀释的。我们实验室一般是做四个梯度，4倍、4倍的稀释，即：1、1/4、1/16、1/64。

fwyou

回复 linlicau 的帖子$ U" L& Y4 y" b: n' G9 _$ Q' O
2 w) }" E( T' m4 ]* `% x
非常感谢 。。。。

linlicau

' _& O) s. {* F

fwyou 发表于 2011-8-1 23:58 6 q  i5 J' i2 Y( N+ j% J; O% \
回复 linlicau 的帖子% U/ t) g1 d1 H& f2 \0 E: Z

' Y( |  L' {' S呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个 ...

3 A1 l9 g0 ?0 s! j6 X, e% g: L0 v$ M9 G$ I/ ~
同学，可能是我没有说清楚。我再详细说一次吧。
4 n/ s8 l8 B' i: S9 Z, H
; s+ ~& O# K7 q8 Z在真正的用qPCR做基因表达检测前，需要对用于检测该基因的引物进行测试，测试的目的主要是看此引物是否特异（特异的意思就是只能PCR出你要的基因中的片段，而不是其他基因中的片段），. M% b; \0 n7 j. Y

* K. E/ t$ f: ~( A4 G特异的检测标准一般就是：你做两个组，一个是水空白对照组，即：其他成分加的都一样，只是template只加水，三个重复即可；另一组是实验组，也就是template加入的是应该包含你需要检测基因的cDNA, 三个重复即可。是不是特异就看：加水的组本应该没有检测到任何的表达，C(t)值应为N/A；而实验组应该有表达，并且你在看melting curve的时候应该是单峰，没有别的偏峰。且最好实验组的表达的C(t)值应该在35以下。然后，等realtime PCR做完，最好跑个gel验证一下，是否实验组只有一条带，且这条带的大小应该与你设计的大小一样，比如200bp（一般realtime PCR片段长度为100-300bp）。
' F3 ~) O; P. N, a4 z# y; Y, p
' g  @5 m1 u6 z/ }! @3 n如果这些都ok了，那么你就可以做你自己的实验了。$ s" n- h3 @' Y# A* D
, g6 ^( x4 `* z+ P2 a+ P/ m3 R
在做你自己的实验检测某个基因表达情况时，最好每个样品做三个重复，并且同时要做ACTIN或者GAPDH作为reference，最后要对通过实验组对这些reference基因normalize之后得到你要的相对表达值。你就可以看到在不同组织或者不同时间你的基因的表达情况。

fwyou

对了 模板还做梯度稀释吗？

fwyou

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4 B+ s. j6 D6 d- o# w/ @  f  C( C+ R) H
呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！  t/ \& X* ^: `4 @6 @
每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？
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谢谢啊

fwyou

呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！
8 m# x0 m1 N8 a& y) i) N$ q; U. q每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？
0 b' y# g) S' c- [4 f4 S4 w4 u! ^0 A& N5 n
谢谢啊

johnnymmzhrt

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2 c# k, s9 x0 R
, k& W2 v% F( z( {$ {  R( t你是要评估引物的效率还是别的什么？如果是引物效率的话一般三到四个重复就可以了. Z7 }4 p% c! a# j6 M0 {
但是貌似扩增效率这个东西很难评估的吧 不同的引物 不同的模板 不同的缓冲液配比都不一样 甚至连不同仪器之间都会有差别的吧。。。

linlicau

fwyou 发表于 2011-8-1 21:15 8 n2 ?+ I% z0 ~# h
想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

$ M$ Q/ A. N6 q% |: v; a3 m1 k$ P
什么叫扩增效率？
2 F( v. D1 p. b- ~7 |! p$ [$ i1 N5 G+ Y) }5 e/ T
在做qPCR是要先test你的qPCR引物，看其是否特异。也就是在对照组（加水）和实验组中（一般每组3个重复即可。）先test一下引物，看峰是否单一，C（t）值是否合适（如果此值在实验组中为35以上，要么说明引物扩增效率不好，要么说明此基因表达量很低。）。对照组水中的C（t）值应该为N/A，或者在38以上为好。