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fwyou

想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

linlicau

fwyou 发表于 2011-8-1 21:15 0 E  T4 Q( Q. ]7 |% S
想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

4 o( P. R/ |) v6 S8 ]' b什么叫扩增效率？
, x1 l6 N; o1 Y3 q7 R5 i
! }0 c6 T( \% ^& `  ~2 x6 n在做qPCR是要先test你的qPCR引物，看其是否特异。也就是在对照组（加水）和实验组中（一般每组3个重复即可。）先test一下引物，看峰是否单一，C（t）值是否合适（如果此值在实验组中为35以上，要么说明引物扩增效率不好，要么说明此基因表达量很低。）。对照组水中的C（t）值应该为N/A，或者在38以上为好。

johnnymmzhrt

回复 fwyou 的帖子" l8 ?5 \4 v5 _- U

+ U7 l: ], _6 E7 h你是要评估引物的效率还是别的什么？如果是引物效率的话一般三到四个重复就可以了3 B! d  M2 L- g5 f* J" A
但是貌似扩增效率这个东西很难评估的吧 不同的引物 不同的模板 不同的缓冲液配比都不一样 甚至连不同仪器之间都会有差别的吧。。。

fwyou

呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！8 v! P& H/ c1 l/ p: |, |
每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？6 g6 q8 n$ l  u/ t- g9 P+ `

0 T) _1 P3 T' s- \+ _; u* P, C( v谢谢啊

fwyou

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呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！
$ W( z  C, p9 i1 c! O3 d9 f7 ^每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？
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谢谢啊

fwyou

对了 模板还做梯度稀释吗？

linlicau

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fwyou 发表于 2011-8-1 23:58
0 `: d0 B  \: m回复 linlicau 的帖子* O) `3 q. z0 C; P6 g! d$ T/ V
4 B2 S) Z+ q! \- M5 v
呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个 ...

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" {9 a: D  o5 E; |+ F& D
同学，可能是我没有说清楚。我再详细说一次吧。* q! r6 c1 _# S5 f# \! y

- E2 i- \1 n- d: Y5 d$ ?在真正的用qPCR做基因表达检测前，需要对用于检测该基因的引物进行测试，测试的目的主要是看此引物是否特异（特异的意思就是只能PCR出你要的基因中的片段，而不是其他基因中的片段），
* \8 ~/ k- L, J; R
* @4 r+ E, X+ j8 R- j特异的检测标准一般就是：你做两个组，一个是水空白对照组，即：其他成分加的都一样，只是template只加水，三个重复即可；另一组是实验组，也就是template加入的是应该包含你需要检测基因的cDNA, 三个重复即可。是不是特异就看：加水的组本应该没有检测到任何的表达，C(t)值应为N/A；而实验组应该有表达，并且你在看melting curve的时候应该是单峰，没有别的偏峰。且最好实验组的表达的C(t)值应该在35以下。然后，等realtime PCR做完，最好跑个gel验证一下，是否实验组只有一条带，且这条带的大小应该与你设计的大小一样，比如200bp（一般realtime PCR片段长度为100-300bp）。/ A9 \- \1 B- a" }  D

# z  n- l' U1 v' \/ v如果这些都ok了，那么你就可以做你自己的实验了。
0 F. q  h6 G( T' V: t8 T/ s
- ?: H' ^+ s3 Q" c在做你自己的实验检测某个基因表达情况时，最好每个样品做三个重复，并且同时要做ACTIN或者GAPDH作为reference，最后要对通过实验组对这些reference基因normalize之后得到你要的相对表达值。你就可以看到在不同组织或者不同时间你的基因的表达情况。

fwyou

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; k4 h/ r* C& P( P* K. s* }# K! Q* \  J. @# G: C$ c
非常感谢 。。。。

echowdk

回复 fwyou 的帖子2 i. _3 a" k$ E3 t* v  Z; Q5 I

# L8 j" m! a! |在检测引物的扩增效率时，所用模板是需要稀释的。我们实验室一般是做四个梯度，4倍、4倍的稀释，即：1、1/4、1/16、1/64。

mansnoopy

我们一般是复孔3个，然后整个实验重复三次