求教 群友高手

fwyou

想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

linlicau

fwyou 发表于 2011-8-1 21:15
  P$ ?' M4 M) D; @想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

0 |* h, f2 G3 Z0 C8 F
什么叫扩增效率？
9 L% \- F. G& R$ o+ a7 a/ J
+ s: z/ v+ s. S! Y" _* U) A在做qPCR是要先test你的qPCR引物，看其是否特异。也就是在对照组（加水）和实验组中（一般每组3个重复即可。）先test一下引物，看峰是否单一，C（t）值是否合适（如果此值在实验组中为35以上，要么说明引物扩增效率不好，要么说明此基因表达量很低。）。对照组水中的C（t）值应该为N/A，或者在38以上为好。

johnnymmzhrt

回复 fwyou 的帖子
, v( f  S6 {+ o8 x% C& q- C' |* ^% R+ Q: G' W5 v. i: O& O. K
你是要评估引物的效率还是别的什么？如果是引物效率的话一般三到四个重复就可以了
5 R( p, C9 Q( G+ N+ l& ?$ t0 \3 a但是貌似扩增效率这个东西很难评估的吧 不同的引物 不同的模板 不同的缓冲液配比都不一样 甚至连不同仪器之间都会有差别的吧。。。

fwyou

呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！7 ^4 M7 @. @1 Q/ k
每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？
8 M$ \; |9 Y7 ^  d) k6 p& B# `6 x
6 N+ e% Z6 M2 `' ]* l$ I0 |谢谢啊

fwyou

回复 linlicau 的帖子
9 {9 l- }( Y- M  j% W6 }  ?& K8 a4 ]1 ?4 ]
呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！9 C% r) y! Y$ S! A3 m
每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？
; K+ M$ x; w" ?3 _) t
3 U8 y) F: C! ]- a8 n1 h0 u谢谢啊

fwyou

对了 模板还做梯度稀释吗？

linlicau

, X: \, L+ \  h2 {

fwyou 发表于 2011-8-1 23:58
9 r2 Q/ \: ~, R7 }; q回复 linlicau 的帖子
! A# a, L  e& d9 U8 Z
& G* P6 |% [" \( m0 ~呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个 ...

. k& N  P  O$ k3 `* O
6 g' t7 U+ j% T7 r5 g同学，可能是我没有说清楚。我再详细说一次吧。  H" K2 n+ J/ G" F) w8 K% r
7 B9 \5 @4 P  \0 @5 k9 f) w; K' r  m
在真正的用qPCR做基因表达检测前，需要对用于检测该基因的引物进行测试，测试的目的主要是看此引物是否特异（特异的意思就是只能PCR出你要的基因中的片段，而不是其他基因中的片段），
/ G, E' E+ D6 D5 Z; S- J0 r4 L) t' X9 z
特异的检测标准一般就是：你做两个组，一个是水空白对照组，即：其他成分加的都一样，只是template只加水，三个重复即可；另一组是实验组，也就是template加入的是应该包含你需要检测基因的cDNA, 三个重复即可。是不是特异就看：加水的组本应该没有检测到任何的表达，C(t)值应为N/A；而实验组应该有表达，并且你在看melting curve的时候应该是单峰，没有别的偏峰。且最好实验组的表达的C(t)值应该在35以下。然后，等realtime PCR做完，最好跑个gel验证一下，是否实验组只有一条带，且这条带的大小应该与你设计的大小一样，比如200bp（一般realtime PCR片段长度为100-300bp）。
$ E) b1 ~- o2 L+ T9 P. d; ]
! J% r  B/ w4 U% o如果这些都ok了，那么你就可以做你自己的实验了。2 o1 m2 S$ S( J: F) ?

& N& J: F. a( z在做你自己的实验检测某个基因表达情况时，最好每个样品做三个重复，并且同时要做ACTIN或者GAPDH作为reference，最后要对通过实验组对这些reference基因normalize之后得到你要的相对表达值。你就可以看到在不同组织或者不同时间你的基因的表达情况。

fwyou

回复 linlicau 的帖子1 T6 J7 j& o/ j# ?' y! T: p5 A

/ M: a6 j5 _! d. @9 N非常感谢 。。。。

echowdk

回复 fwyou 的帖子1 L1 o: G0 P4 S: X  }/ B9 v
6 A* g5 I7 v0 t# D4 N. h( i
在检测引物的扩增效率时，所用模板是需要稀释的。我们实验室一般是做四个梯度，4倍、4倍的稀释，即：1、1/4、1/16、1/64。

mansnoopy

我们一般是复孔3个，然后整个实验重复三次