ips全军覆没，我该怎么办？

rongrong

大家好，我是一个IPS的培养新手，我4月份冻存了一支ips，冻存液干细胞的全培养基+FBS+DMSO=6:3:1，复苏时铺好饲养层，将融化的IPS用全培养基洗了两遍，每次离心800转，5分钟，然后用新鲜培养基重新悬浮细胞种到T25的瓶子里，但是第二天发现好多好多都漂了，没飘的居然都是单个细胞，我都快被它整的窒息了，大家看看我哪里出问题啦？这是为什么呢？现在就是叫天天不应叫地地不灵啊，老板明天有要批评了，唉！干细胞太折磨人了

oucflora

冻存时DMSO浓度过低；0 f0 Y! U- z2 D7 j/ J/ v1 y# l( l3 A6 J
另外不知道你冻存和复苏的操作程序是怎样的？最好详细说明，好让大家看看问题出在什么地方？

evial

细胞死了是经常有的是事，再做一次，照英文版的做

Yedan

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( N0 b# F$ \: Q5 ?/ i# H7 V; e/ q5 s
10%的DMSO难道不对吗，您说低了，求解释……
- R; V  k0 v5 x9 q' a

Yedan

回复 rongrong 的帖子" n  o( l4 s' s2 O- @4 I
: u) z; ]$ i8 U- P( T' }
800rpm 这个转速是不是微低了啊，您确定细胞都离下来了？
; v! U6 {8 z) T我们实验室从来都是1200rpm的。。。
* R! k4 E" U) @  u: }8 `
8 d2 M( d$ a# b  G3 K" _1 t9 a补充内容 (2011-9-4 17:27):
, z* r* G5 S( T) I  i, r" J6 z4 u另外，不知道你养的是人的还是小鼠的，如果是人的ips，复苏之后死很多很正常，我们实验室的博士后说她在美国养的时候，经常是0.1%的存活率。

oucflora

回复 Yedan 的帖子! Y) i' C+ A0 f3 R

1 a% z' V$ K) N/ v2 ]8 d' f  t  A在冻存细胞时，DMSO浓度太低，会导致细胞在冻存和复苏的时候细胞内容易形成较多的冰晶，造成细胞成活率较低。

jefferson

ES和iPS的复苏效率是非常低的, 楼上也有人说了, 大概0.1%已经不错了.  对于冻存液, 我们用的配比和你的一样, 但是在冻存复苏过程中有几个问题需要特别注意:
. m/ D. S. e, n$ g; \9 k- y+ k( m- J% L9 J+ D
1. 冻存后先放至-80度冰箱过夜, 第二天转液氮,不能在-80度中放置过久, 否则复苏效率会更低.4 w) _7 x9 h( ]
2. 复苏时,从液氮中拿出后马上放到水浴中解冻, 待融化至一小团冰块时即可, 马上转到无菌环境中开始操作4 w& i5 ~" w" z3 Q: m" t
3. 先将细胞悬液加至离心管内, 然后慢慢滴加ES培养基, 边加边晃动, 使其中的DMSO浓度逐渐降低, 减小DMSO浓度迅速降低对细胞的刺激.
% S* s& E& P6 ^" I) k8 R4. 离心时最大离心力为200g, 因为不同大小的离心机在相同转速下的离心力是不同的. 所以需要用离心力来标定.
' G  I2 i9 [. c% a5. 离心后接种到MEF上时, 如果有条件, 可以添加Y-27632, 一种ROCK激酶的抑制物, 可以很显著的提高ES/iPS的复苏活率.

rongrong

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: t* I* c1 T6 F) i% ~" p4 o" X7 V+ ~* L5 u( l
我冻存时是采用裹很多脱脂棉，然后放在泡沫盒中，直接冻到-80，好像两天吧，然后转到液氮，但是前段时间实验室液氮出现过一次液氮特别少的情况，不知道是不是有影响；复苏时我将水浴锅开到38度，立即化，取15ml离心管加5ml培养基+冻存的细胞，800转5min，重复两次，然后重悬细胞接种到饲养层上!麻烦指点下。。。

rongrong

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5 N% ?( s, P, u) C1 U6 N2 B5 O  b7 {7 I7 P& B! }; z* ~% F
英文版是啥啊？我是新手，好多东西费了包包但是不能下载啊

rongrong

回复 Yedan 的帖子( @. O4 y/ w3 ?1 K' T* C; g( T9 z

" W0 r6 T- K4 R+ X是人的，800转看起来是全部离下来了，我听别人说他们都是静止放5分钟就好，主要我得细胞都变成单细胞了，不再像以前那样一个个克隆了，总是离心，吹打这样不会影响细胞的存活吗？再说刚复苏的细胞这样折腾能行吗？我就是想看看大家都是怎么复苏的？