请教高手：怎么才能做出好的ＥＢ呢？

wawj

我是做ｍｉｐｓ，做了几次ＥＢ，都形成不好，不是圆圆的，要么很散，要么奇形怪状，还有“三胞胎”，“双胞胎”。我是用悬滴法做的。求教怎么样的细胞状态才算可以做ＥＢ进行下一步诱导分化呢？怎么才能形成好的ＥＢ？

刘森泉

回复 wwy551 的帖子7 e. g' ~) n+ I4 ~
' y( s: p4 [. a" y- C  L% G$ D
好消息。昨天根据你的建议，先用胶原酶消化十分钟左右，等到ES边缘卷起时就用移液管刮培养皿，全部刮下后移到5ml离心管里自然沉淀，几分钟后吸去上清，重悬后铺在MEF上，长得不错。我之前的克隆好多分化，希望这样的效果能好点，减少点分化。你觉得这中间还有什么需要改进的？谢谢！

wwy551

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3 j) H! ~1 c2 l7 s1 z) |# j- Q1 |% I* e' K" B- `/ H" N4 o8 m
就常规传代ES的做法操作就可以啊，不知道你平时是怎么传代的

刘森泉

回复 wwy551 的帖子0 h1 K) P, z! @1 a9 c

# m4 H/ ~8 M8 P1 u$ P) a" [. B分散酶消化后，用移液管在显微镜下一个个刮还是大范围地刮克隆呢，如果没有目标地随机刮的话是不是不用酶消化啦？

wwy551

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9 |1 H/ Q4 Z* e% y$ m我们都是用1ml的移液管刮克隆，当然你消化克隆的时间也得足够，看到克隆边缘卷边的时候再刮。刮的时候，移液管垂直培养皿底面。枪头的话对细胞损伤太大，我们从不用来刮克隆。

刘森泉

回复 wwy551 的帖子1 n, W* }* {! d$ W6 ^1 U5 p
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你刮细胞使用移液管吗？还是1ml枪头？我昨天用枪头刮了ES和iPS，今天看了下，看不到克隆啊，都是散的细胞了，要么是分化的团块。最近养ES养的头疼，很多次请教你，麻烦了。

wwy551

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. s1 M6 m' q* @; u9 M你用的bFGF浓度正常，MEF有点过了，别传到5代再用，四代都勉强吧，最好用三代的，这样的MEF状态会比较好，分泌FGF的能力比较强

刘森泉

回复 wwy551 的帖子9 l" p( w8 B0 R
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谢谢。我用的是CF-1的MEF，5代之前，ICR的也用过。bFGF用10ng/ml，perotech的，那接下去提高点浓度试试。

wwy551

回复 刘森泉 的帖子, l7 `9 `! e$ a+ _; x* c( }

" M$ Q2 y7 i; N5 J$ V5 p" M你这种做法治标不治本，建议重点想办法调整ES状态。
/ F3 z8 p; }. r& x问题可能出在你用的MEF上。不知道你用的feeder是原代的MEF传到几代做的，建议不要超过三代，而且每次传代的时候比例不要太高。或者你可以适当提高你现在养ES的培养基的bFGF的浓度。总之，不管接下来要做什么，一点得先保证ES的状态很好，不然做下去的话也不会有像样的结果。祝好~~

wwy551

回复 刘森泉 的帖子$ p- a- b3 x# f+ f

, y( z3 [1 u) K1 f& }8 s你这种做法治标不治本，建议重点想办法调整ES状态。( |- |2 ?7 l0 R4 T
问题可能出在你用的MEF上。不知道你用的feeder是原代的MEF传到几代做的，建议不要超过三代，而且每次传代的时候比例不要太高。或者你可以适当提高你现在养ES的培养基的bFGF的浓度。总之，不管接下来要做什么，一点得先保证ES的状态很好，不然做下去的话也不会有像样的结果。祝好~~