高手请进！脐带间充质干细胞组织块法分离失败。第3-5天组织块间很多膜状沉积，求解...

quge_00

" s7 ?- V" }' \7 w+ m) l
, L9 K. t. M  G+ k3 r0 l谁能帮看看我的实验步骤：3-5cm的wharton胶养一个60mm的培养皿。
# U' i" R9 \( J* A1、无菌收集脐带，浸没于含1%双抗（青链霉素）的4℃预冷PBS中，清洗表面血污； 0 W) m/ ~" S* D# l6 N
2、灭菌棉线结扎脐带一端（1cm处），另一端固定于超净台，将脐带浸入4℃含双抗PBS的灭菌容器中；
8 |6 M7 s' z6 x3、超净台内用手术刀片环切距线结端约0.5cm处脐带外膜（勿环切过深），用皮钳将脐带外膜整张钝性剥去；止血钳钝性剥离2根动脉和1根静脉；0 u& F( ?9 J* d  h  k) _$ D
4、距线结端约0.5cm处切断血管和华通氏胶，再次用含双抗冷的PBS洗净血污。将华通氏胶剪碎至约1mm3，转移到50ml离心管，用PBS以1000rpm两次洗去粘液；
8 s; i' s" _3 N5、将组织块转移到细胞培养皿中，使组织块分散平铺在培养皿上，间距为5mm，入37℃、5%CO2孵箱培养30-40分钟使组织块贴壁； 3 V0 @* B) j) o+ x5 `3 K+ ^% `
6、加入DMEM/F12培养基（含10% FBS）6ml后，入37℃、5%CO2孵箱培养，5天后半量换液。

quge_00

养3-5天，组织块间就开始有一层膜状物，没有细胞结构，像是死细胞或者是蛋白沉积，一晃动就能剥落下来一层。但是总是很多，显得很脏（换培养液是感觉很粘稠，像胶水一样）。已经养了4批了，只有一个培养皿像是MSC，但是可喜的是还没传代就莫名其妙的死掉了。。。, h" u) f- P: |! m5 m1 }
换过FBS，培养液需要换a-MEM吗？" J0 R9 t7 `- Y* d( X0 {

quge_00

+ z: V* D; ?) ^
  ^! k, ~* d3 C6 z
底面观

quge_00

正面观

quge_00

现在问题是这层膜怎样处理呢，挂掉害怕组织块松动；留着的话细胞是不是没地方长了？
0 i! p* v$ A2 j4 K最要紧的事显微镜已经很难透光了。。。。。。$ C$ m1 k$ x* j; j4 T4 H; A3 `
高手速来，0 r7 L1 K# m8 |/ O& `0 K2 n$ L
感激不尽啊。。。

xxuudd

怎么会有膜呢？是污染了吧？& a# b& C6 j: x+ ]* K- J% k9 X

单个核细胞

# T- d) Z- y  k+ q: j& ?! ~
# ?% ~/ q8 \, b. T- D3 S6 v回复 quge_00 的帖子+ M: V+ v6 R; G6 ?. ~
8 |/ o: m$ y4 X5 W  D  b/ C/ j
推测为污染，建议重做。/ N% @% N+ y' O- J' }2 M; |$ l* r
% X" u  B( Y0 N8 g/ V
你可以这样试一下，不要剥外膜，先将脐带剪成小段，然后组织镊剔除动静脉，直接剪碎，贴壁5小时后加入完全培养液，静置培养。" d7 k6 ^/ q" ]! ]. j, u- v4 N

$ A' {& ~3 b/ M熟练之后再行脐带华通胶组织块贴壁培养。

sdwzg119

4 U4 h, h0 M4 u! Y% I6 L9 O' X3 O) V( {+ `5 B; v
回复 quge_00 的帖子
# L6 i/ o* S. E5 f, L* {& x7 h( O2 O, X
不会有膜的，我认为你这是污染了，现在组织块贴壁法样脐带MSC挺成熟的。
0 D% c0 n1 V- g3 ]+ ]你描述的3-5天有白膜长出，这个时间正是细菌生长出的时间，你连续四次都这样，说明你无菌处理的非常不到位。
. v: p0 |" d1 e5 Y) t5 ]
: I% f' s- \0 l1 ^/ Z/ C, `/ w$ l脐带，你光指望双抗水是不行的，它可能有非常多的真菌，我建议你多冲洗一下，起码冲洗10遍以上，去脐带的两头。

quge_00

回复 xxuudd 的帖子. l# b( t3 X- F- p
5 m8 J: G7 G, l* [! y
谢谢！最近整个培养箱都出问题了，污染也非常可能。。。

quge_00

回复 单个核细胞 的帖子; |6 V+ v+ w; ^) {. Z% c, |! ^. V

) e: ~" h( s$ D( m非常感谢~~~最近整个培养箱都出问题了，我想也很有可能污染（还有几次长出霉菌菌落）。。。弱弱的问一下：粉碎后静置5小时不怕组织块干掉吗。。。。？？