荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

. b' l( b0 j% c# O; O. W! V0 l. A

  u5 D' _" B& V/ S2 ]最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？0 Z5 Y+ q# |% @3 k9 J. z

3 d) M5 Z8 M7 l8 O) f# O3 X看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。+ }) v# n( m; Z
不知道是否有探针数据库可以查询？
+ e+ f" c8 }5 B5 c0 B" L% J  x0 P% a8 I$ U/ R9 _
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？" @# |- p; L5 L8 D: G$ J9 K0 R' x
$ u+ s+ `9 Q' A
求高人指导~
6 \6 \/ D% M0 f1 j5 u3 A" N

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子; `, A& z0 Y+ y' O8 {* M
: Q9 U' U/ T9 f) v3 t$ {1 [. V
可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

7 t" ]" ^) X* w+ v" X4 ^) X8 t0 ?# E! D7 f! r: k
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。
* y8 J% B6 \8 Q' M5 u9 p用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。
; ?: j) V* a9 E; W4 E1 @上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。
: u1 m, o; G  o6 x0 } standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

回复 weiyepan 的帖子; K, C% P; h0 X. h
0 I7 e1 ~" w$ x, [
果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 2 t. N8 L$ |, V! P/ |5 U
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

; v3 o. J$ G/ D# c4 T
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

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# L# Z: s' A, C' \& k/ ?4 F9 |8 _3 E
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s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。$ k1 P4 y8 {" W
TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
% y( X/ J4 P1 ]# s: _几点注意：
4 Z$ _7 f& r, U+ K1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。
* H' K" B1 M. }* ?( _* Q1 C' U2 z8 ]; z2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。8 I& [' r* \  z4 J, c
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。  U+ x; F- A: Y; i7 P
4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。) K/ M/ r0 W' M( m

l19rna

回复 huangxf1998 的帖子" P) z- }& ?0 o7 z( `2 m9 ]! d

. [$ n1 A& D0 ^! T2 S第一次已经失败了啊，唉，呵呵