荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

% |, e! |0 Y2 I/ @) m. ~1 H9 D

( m$ V/ ~0 L9 B/ A1 n最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？
; }* i# P- I' y0 |% u. j. f  p, {+ f8 T3 o$ n: F6 E
看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。2 ?9 r! y2 P* v9 q
不知道是否有探针数据库可以查询？
3 s' t2 \0 e) o9 C! h" m( q; T6 ^( A, i% {" K
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？
" h6 R/ t  ?; f& p
: m$ t! m; w: {/ T: ?( H! d求高人指导~
: F5 H5 b+ v- s8 _

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子% I) i: C! `) `4 \' k5 m

, p( r3 v/ R. r* V3 N可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

  x" f' h" a# x6 t
. B1 ^' x0 w5 m# S0 D: c& w
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。7 f4 B" V2 q2 A, B7 N4 \, M6 ^- d% Q
用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。
6 A6 Q& i* Z! D2 \6 }$ G% R上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。" K4 o/ B+ O6 C$ `8 x
standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

回复 weiyepan 的帖子* }7 M! n: j1 T* X

) F. F' d5 c+ S0 l# m4 X果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27   F5 J# C2 a$ {: i4 i
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

* A  X* p/ x" K' ?
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

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; F$ v& v' S+ o" r+ L
2 J, n0 ~* A" n参与讨论 获得积分

s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。
3 E/ _" }6 w# ~2 {TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
$ i4 y% K/ \4 y9 n几点注意：$ y% ?1 E$ v6 f5 x
1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。
  G0 U, A; {3 a2 E2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。
3 o2 d9 D) V0 B3 ?+ H; Z2 G$ u, T( g3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。
2 ^* Z7 ^2 J' u) W/ j4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。2 `3 @3 F5 U, j$ c5 j' R( }

l19rna

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# w, [* G1 N$ G9 E( y
7 ^+ W( ~1 A% ^: E( @/ s6 W) L( y第一次已经失败了啊，唉，呵呵