荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

$ F) U+ _7 v" u3 z6 G0 o4 v- ]6 j+ W2 P9 G% Q: N' [
最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？% B% p9 n8 @- H9 A& `

6 w5 c" ^5 `2 L% Q: d看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。
) W4 n) Q% r2 h5 t+ i; b0 U不知道是否有探针数据库可以查询？, p; [7 U/ H- o
  S. J2 i7 S: w7 N" ?- H
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？% A! O2 O( T+ m7 i

& ?4 O8 f0 ^! Y3 T5 \$ ~9 [求高人指导~
" ~' o2 V6 ?/ a

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子
* m. b7 Q* i5 M/ f  x0 J, P/ e* @* N0 v* x6 {+ P* A
可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

6 W. ?! C' I: B$ N' G' c: O# Q. M% x- z" n
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。
& X# u% v+ d' \  O) m用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。8 s+ H; l% w5 e5 O0 p
上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。
. U( b% l0 d  z( Q4 T standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

请用IE浏览器下载
下载积分: 威望 -2 , 包包 -5

l19rna

回复 weiyepan 的帖子
( H: W0 A8 a, X0 C) a% [) x' u
  K! J9 N5 K- y  b) M5 P: P+ t( I果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 , R' H/ W/ C+ i8 v7 G& N; Z2 N' V
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

3 n* F; V; F/ G' l& ~* W! h
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

回复 kkmmkkmmkk 的帖子: b# s5 L8 O9 Y. e! T: ]8 B

/ h9 ~8 U% U# A# @参与讨论 获得积分

s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。
! }4 |# L# V) D" lTA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
/ w% I* ?) v5 K+ s8 H几点注意：% S2 n; ^6 F' d+ D9 ?8 U
1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。
8 e" K  N5 ~1 n% m2 n% @. f2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。
( F8 d' a7 y7 ~3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。0 J) e) ^6 Y5 V( Z
4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。! s/ B, B& o6 J8 a% `

l19rna

回复 huangxf1998 的帖子, e+ r+ ~$ ?" T0 d
7 b7 Z: A3 a/ c; s
第一次已经失败了啊，唉，呵呵