荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

8 @' X3 m& t4 J! a, J$ o% d$ ?! D) F( a
最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？
1 B8 |+ ]8 w6 U. ^. A
( T, {4 F0 S1 ^) r  j  E看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。! s1 a# P4 b) U; k
不知道是否有探针数据库可以查询？. F6 q4 D7 Q2 T2 V4 a
0 o1 N- `. h9 I- n
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？
  n, A1 \  ?, V: q
4 b# P+ z, H7 P% V3 h* x求高人指导~
8 }. C5 D" l( ^( @2 ^. S

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

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2 i& R: ~: d# h* `% {0 h! D0 O- s. ^, `$ D
可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

; |$ a/ V7 K: `) |4 K
9 F# E5 `- \' F& e, {
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。
% L* T. f9 m: h* }1 D用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。. q; \3 ^0 ]0 a9 D' K" _
上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。
; X3 t6 \/ e! O4 v! z6 L standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

回复 weiyepan 的帖子6 l7 v( ~4 Z9 x5 c" o

7 B: V+ w3 _: G/ H' `3 e' O果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27
$ }# t- Q/ _, @- `' S8 f. J如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

; X- ?# D. W& a0 k
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

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" j6 B) j- L% z/ L  }5 c1 r* k7 g. b) n6 I7 r
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s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。
: ^/ n  I) M( _6 ^: C2 _TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。) N+ Z3 d- J+ c+ E$ I* w. _. F
几点注意：2 }& v1 @( j# _; J/ Q
1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。
9 _& r! E) r' L2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。
$ Q5 W, A* j5 F1 S$ N5 Z3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。
: u* C" A# k7 V- S4 O- K' t! c4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。6 b6 e- T* c" k4 M. z- U. Y

l19rna

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$ a. V% b6 K/ t" D
' `- F* z- ?# j' q0 ?9 J" N% T) ^第一次已经失败了啊，唉，呵呵