荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

0 d! a" s0 v0 v! {1 f% c% Y& |3 f$ `. V& s6 `
最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？
7 y  [# z, A7 z' s5 g6 ?) W
+ @5 T/ S. D  E& [; b7 T/ e$ s1 t看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。
0 g0 P; ~. j8 H/ n  H: ]# M不知道是否有探针数据库可以查询？
; Q" {8 }/ D! \! @8 b7 }# }' R$ N
) S* c- Q+ F! C+ @, l  i自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？* B( [2 m2 {% g1 H4 z# e
8 M  H3 C) P; D
求高人指导~2 J5 ?* ^) A: `

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

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+ E6 ?) E! X3 N/ e( S- O; X* O; S9 L- `6 o; |7 b1 L" T
可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

5 D5 B9 t6 ^+ B# J1 Q3 P. A
9 x! z! m8 r3 L4 u如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。
, s- J% b4 r& X4 v1 M* ?用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。" U$ B9 b6 M  l/ B
上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。
8 ]8 W% r2 E9 f' r) y" |8 | standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

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1 Q& h1 D% M# j# M' P: A! a, [5 R7 K  ]
果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 $ S. o* {/ q6 d# Y* U- _
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

' c/ @$ E6 Y: z附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

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& p' A3 D' a" x7 u
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s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。
! }& b" a$ B5 Q6 zTA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
, u$ d1 x8 o0 i' L几点注意：
0 h* |/ n6 w! F" Y1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。9 W6 U$ S8 _% [8 ], [' Q6 B, Y+ U  J: t
2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。4 z' n. J/ k2 g* o
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。" {* I/ a; T3 s# j; t
4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。5 r" B$ T8 s4 `$ A% e* w: D- W* e

l19rna

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1 {9 Q) `. k* L: [. k* h9 t0 J" l  {" S
第一次已经失败了啊，唉，呵呵