荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

0 z6 ~+ a$ `5 ?( L/ A+ T8 Q, _. M3 Q" q, i+ O7 d4 a4 H
最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？
) a: u" s: L1 [3 D
4 F5 J8 @# y5 t看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。& i8 _* }; D# z, e% S; u5 |
不知道是否有探针数据库可以查询？
- [( \1 g( H1 M! @# E" F- ]+ _$ `% k) C0 p
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？+ Y4 _$ w: W& Y. {2 u4 ?* e* Y
+ F; o3 N& Z9 C0 l# Q# h
求高人指导~
7 e6 M  A7 a* A( B. \

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子- x0 A0 d) a5 {; j& A) K
7 C% |5 l! H8 A  d: D
可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

& ?* n, _6 G9 q, e6 Y% n" \8 C

7 D9 h; [7 i6 t, p- y如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。$ Y* H( Q+ P( @4 R& f
用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。
) \5 b4 y- _/ `2 L上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。! b" l! V9 H. U$ D# a+ v
standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

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: ~. A- ?6 k9 m1 f6 t# i5 z/ M' Q. h0 R* v
果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 % o! h7 |/ |' p, n
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

& H$ w! s2 \5 c9 g: a
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

回复 kkmmkkmmkk 的帖子& z) ^% F( i! @5 P# |% d$ \+ A, w. {4 N
9 f2 Z: ~* B+ _. v
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s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。( B# {& k5 V2 e5 O! @# l  }5 \" K
TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
. O9 I' a, w0 X2 \% h& N# f4 v( S几点注意：2 a( y) u& R$ H" Z& S4 p
1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。6 @1 ^+ [9 ]: }  Z  ]% l/ o7 K
2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。9 T9 J, `4 t7 L, G2 ]
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。
' |" e# p$ C- o, E4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。7 C4 X4 J7 x3 k7 ?5 G

l19rna

回复 huangxf1998 的帖子! v/ T' N' i1 M+ `2 P5 E+ \3 Y+ s

0 m) X) f% `# L3 ^. W' b* G第一次已经失败了啊，唉，呵呵