荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

- M8 z0 e# z" m4 O8 h0 x% N8 s; u: X9 k
最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？
) [# ^) C( Y4 Y+ o1 G$ ?6 q% F- q+ ^/ M
看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。
) W3 `6 \. H+ f6 ]: }1 r' h. V不知道是否有探针数据库可以查询？( Z% _0 e# P& o" l3 N( i
, @0 a$ Z/ r' f
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？, A: l( g, X) `# V9 b+ x# P$ L

3 j. |3 k+ o' P  o7 V) ~9 S求高人指导~4 }5 [) f$ s- Q% I

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子  v8 {2 t5 R' ]0 _( g

) L& E( X% |7 n& p7 |  z  p0 a可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

# Y' H4 ~: {9 [8 X- F4 R8 E% N6 _- d7 |5 D1 P  S. V1 J/ y) u
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。
1 l% Q/ O' m7 G% S用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。: ^1 q# o" n, d; H- Z, M: _. a
上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。( {% p) i: Z& K, l
standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

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6 ?2 v  y5 V7 c
# L0 o. O& H% n% x+ v果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27
0 Y& j# |$ }" ^, R如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

  |: S7 T" V8 ]2 v6 O  x
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

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9 d! H8 _  ]: [  {. S
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s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。8 t4 B! C- k5 ?1 K! X
TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
- z$ f0 _9 @0 ?& l0 W! Z几点注意：5 ~1 z4 ^6 M* }  N, t- D
1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。
! O4 M3 C# p8 `! S. H. _8 w2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。" _7 }7 o2 e. Y9 T! j/ A
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。6 S* ~9 P9 b( M- m
4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。2 ^  b$ H5 N0 U& }7 x! \

l19rna

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: R; A9 F4 Y( w0 M7 m& l. g: o. D: J6 a/ X# D7 K
第一次已经失败了啊，唉，呵呵