荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

; ^- v; C# F8 Q+ T
/ h8 \$ h  R2 @最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？: _! U( [& h& A( u
( j- s! f% f! J) X8 [. Q
看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。* e& F# i0 h' |2 ]6 \+ V0 E
不知道是否有探针数据库可以查询？
4 f4 i# V& }# c% U, C) Y
2 W7 ]* S  g( T' S自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？
  ^4 W0 H! W# y* w$ \) F0 S
1 t4 ~2 c3 L4 c# O* w! c+ i求高人指导~% [" v: c/ o- J0 B6 o

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子% ?2 F7 X& }0 e3 d% g7 H
% m# X1 h; x3 I! E
可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

* j4 m5 P' k( V' U* U% s
5 B1 e. O4 B% }( K# V
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。
' |' X; y" I% E7 ^用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。
4 c& R" c. H' h2 @上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。- X1 @- P2 }- P
standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

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6 f. P$ o$ A; ~2 x9 z1 h0 Z6 t8 `% ~" l( T  r( R& i3 U+ u% e8 B) E
果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27
+ U1 a: X) T/ x- V+ ?3 J如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

2 y$ E* |7 R, L
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

回复 kkmmkkmmkk 的帖子8 c8 M: v9 }8 g6 W

4 H" Y$ J% J8 V# h& _0 K$ e( j参与讨论 获得积分

s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。6 W7 B9 E" I& N
TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
. x0 S, D% T6 S% U. X6 v$ P+ A4 s几点注意：" H2 O+ A' N! X% O; ^
1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。
0 F" f, Y8 m* ^  G) O& q9 [2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。* I- P- w, f2 v4 Y# X
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。4 b0 D+ f4 U! Q! c# A) d  d
4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。  E, h/ r9 b9 {( u( U

l19rna

回复 huangxf1998 的帖子2 v- C+ R1 {1 G2 T% N; H

! N+ |( A* m4 Z7 n7 q第一次已经失败了啊，唉，呵呵