分离PBMC时的疑问？

gengtongyu521

分离PBMC时，有时会多吸取一些下方的分离液，以免细胞的浪费，这样，再离心时会不会不容易使单个核细胞离心下来，而悬浮在液体中呢？

Jonathan

不会。因为洗的时候用的是PBS，两个应该是可以互溶的。。2 H2 a! p/ W, Q+ x/ u1 w' Z

HHvivian

如果有这种顾虑，PBS加多点。我也做过PBMC的分离，但未出现过单个核细胞离心不下来的情况。PBMC的分离还是比较容易的。

defu

操作基本过程如下：
' K; A" J0 ?$ g4 N  C
0 V- y4 A# {! Z4 `" }1、抗凝血约8ml，2h内收集，混匀充分；9 @  Z% O6 [  Z+ Z" p* z

3 H4 q! U6 E9 Z( v2、复温淋巴细胞分离液及1640；（室温自然复温2h或水浴锅中1-5min）4 X* L. B$ B- L& j# W# M
' \% s2 O2 G" W! ?
3、2支15ml离心管中各加入4ml淋巴细胞分离液，离心2min离下管壁上液体；# h' o0 M$ c2 Y& _

; }! E) v, _/ h% P1 h' F, W6 |4、将8ml血吸至50ml离心管中，加入约8ml1640，混匀；; V! O2 F4 w6 t8 F- i
1 Y% P9 O3 m. d$ j& K
5、使用BD产3ml一次性无菌塑料吸管，将混匀后的血慢慢加到淋巴细胞分离液上；! x0 o6 ~4 t3 `6 h. b; a

3 X. G, T; {9 I- s: e+ c0 D6、1600rpm（440g/min），30min离心；
. }+ U- M4 U8 g! w! {$ a5 Q( M7 U( T- U. O3 N. ?/ i
7、吸取上层血浆，用玻璃吸管吸取PBMC层至一新15ml离心管，加入1640至14ml，混匀；
) p* K) l/ @7 ^& O* r* F6 q# y
+ v/ C$ `; j9 x, g8、1300rpm（290g/min），10min离心；, Z& h8 B5 x4 }9 q9 l8 B
( s# I/ G) Q9 o/ _6 e
9、同样方法再次洗涤。
" W. O) P( J5 w1 b% a8 J" V$ N" i+ C

pengxuleo

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9 q& z/ b  k3 F! ~) l6 }: C- b' a+ f7 m# _
不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

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, c$ G/ n" X9 G3 l2 x不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

回复 gengtongyu521 的帖子) E  Q; p* w% t, S" X1 L

. L* H& W/ p$ @' `1 W/ d不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

easternliu

上面的人吹牛，我之前有遇到，细胞都跑到分离液当中了，所以吸了很多分离液，当时头脑发热没混匀，所以离心出现你说的现象，细胞没下来。所以吸了分离液一定要混匀，尽量不要吸太多分离液，如果没办法太多了，可以适当增加离心转速。关键是要混匀。。。

sunny.yc

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- M0 J! H  ?1 }5 X+ e$ h
* Z. |$ f2 q/ I: N' }$ E4 x多吸一些没关系，只要别吸太多淋巴细胞分离液当中的”杂质“和下面的其他细胞就行了，然后用DPBS或1640混匀一下细胞，完全没有问题，我一直都是这么做的

pengxuleo

回复 easternliu 的帖子' n1 O. X1 s3 t% g

4 B- s5 s+ y7 {你说我吹牛也得好好看看内容啊，混不混匀是实验常识问题，没人会专门提出来