分离PBMC时的疑问？

gengtongyu521

分离PBMC时，有时会多吸取一些下方的分离液，以免细胞的浪费，这样，再离心时会不会不容易使单个核细胞离心下来，而悬浮在液体中呢？

Jonathan

不会。因为洗的时候用的是PBS，两个应该是可以互溶的。。3 ?2 g1 S: P4 r& T9 g7 \3 M* Z

HHvivian

如果有这种顾虑，PBS加多点。我也做过PBMC的分离，但未出现过单个核细胞离心不下来的情况。PBMC的分离还是比较容易的。

defu

操作基本过程如下：
6 M  y0 k9 Z" q7 H
1 G* i; o, Q6 T3 h* z* V1、抗凝血约8ml，2h内收集，混匀充分；# x# O' s: u3 Y9 K6 g: z
2 r  `) u; [3 o) D' M' n
2、复温淋巴细胞分离液及1640；（室温自然复温2h或水浴锅中1-5min）/ h  V4 k  B& i' j+ T" H) ?

/ T1 j# l7 J+ i8 N3、2支15ml离心管中各加入4ml淋巴细胞分离液，离心2min离下管壁上液体；2 A  I& a- G  H6 x  T; e6 C
2 S6 Z3 m! W- ]4 `
4、将8ml血吸至50ml离心管中，加入约8ml1640，混匀；
- t6 r; s9 S& p4 A7 z# P4 B
. s9 S8 s" j5 d! Z  f0 G5、使用BD产3ml一次性无菌塑料吸管，将混匀后的血慢慢加到淋巴细胞分离液上；  ]9 h$ J- d; K  \( f) {1 I# [

  j: I" h' h" H  ~) l3 A6、1600rpm（440g/min），30min离心；
) ]( [, O6 e! p" ?
9 V3 V, w, L  K9 F& ]5 ~# }7、吸取上层血浆，用玻璃吸管吸取PBMC层至一新15ml离心管，加入1640至14ml，混匀；
( m* `# q3 {4 T* X+ o
( S' @2 A. X1 w8 F; S7 @. q- }8、1300rpm（290g/min），10min离心；$ c# s/ d/ d: d2 I6 y% j
' J' i  J9 R- L$ k6 |' [8 ^0 m; S
9、同样方法再次洗涤。8 b( N) J. [; W1 S. ?
+ F9 z+ p" U% I' f( W3 j# t, W+ l

pengxuleo

回复 gengtongyu521 的帖子
6 x! S7 f& Y, {( T9 F, z, f
9 z/ a" W; y+ a: J! O不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

回复 gengtongyu521 的帖子
: u- M  a: h3 M4 E1 U4 r# ]5 v! s, m2 J3 L6 N) ~; ?
不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

回复 gengtongyu521 的帖子% p4 \7 v5 u9 Q2 z4 H6 t$ W: s+ I; y
6 K3 m. w; ~5 {+ X: P' t. k! V
不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

easternliu

上面的人吹牛，我之前有遇到，细胞都跑到分离液当中了，所以吸了很多分离液，当时头脑发热没混匀，所以离心出现你说的现象，细胞没下来。所以吸了分离液一定要混匀，尽量不要吸太多分离液，如果没办法太多了，可以适当增加离心转速。关键是要混匀。。。

sunny.yc

回复 gengtongyu521 的帖子/ n$ x& W# N+ ]; e7 L& Z6 C

5 o+ u9 R8 v! p# g' n3 d5 N* U多吸一些没关系，只要别吸太多淋巴细胞分离液当中的”杂质“和下面的其他细胞就行了，然后用DPBS或1640混匀一下细胞，完全没有问题，我一直都是这么做的

pengxuleo

回复 easternliu 的帖子
) P: C; u; `9 v5 h, j: O5 ]. W) S
你说我吹牛也得好好看看内容啊，混不混匀是实验常识问题，没人会专门提出来