脐带组织块贴壁法求助

湖南干细胞

" e8 x" Z( d8 d9 q5 o8 s- A$ A8 h, p. r6 M+ ?. r" w6 p5 G% ~2 X4 R
将脐带表面迅速用生理盐水冲洗三遍，冲洗干净表面血液。
2 U2 `0 I7 C, u. U9 C! I2 Y' m剪成2-4cm小段，放在生理盐水里，撕开或剪开动脉附近脐带，抽离2条整根动脉，剪开静脉，撕掉静脉壁；将华氏胶撕出来，小剪刀剪碎，再用眼科剪剪成0.5-2mm3。
2 u' o5 N/ y- G8 U4、贴壁：用15%FBS的培养基将T25培养瓶湿润一下，用注射器针头挑取小组织块从瓶底向瓶口铺好；
( f: T8 N7 H1 ~7 b% ^5、添培养液：4h后用巴士管吸取培养液，小心滴到组织块上及组织块周围，以刚刚能没了组织块为宜。2 ]; P" @6 o6 h1 q+ G. [# X5 O  {
以上是我的组织块贴壁法，请教：
9 A6 ]+ u7 q; B3 ^/ S- a①组织块很难剪成1mm3，剪了大半个小时还是有2mm3左右大小，怎么办？
& G* N# t) S8 K6 d/ n②组织块贴壁时，组织块之间应该留有一定间隙还是聚集在一块儿?
5 A- G: k* A/ U4 ]& w. G, U$ U③抽离动脉后，发现胶的颜色有点发黄，有没有找错胶。或者是剥离血管时间花了太久，用了将近3个小时。* H  y2 z# c* j; y$ ?1 j! B: v2 x. U
剪碎后要不要PBS洗涤，还是直接贴壁好？
- o- }# c; Y5 j7 z* E& K9 O6 g用碧云天的多聚赖氨酸铺瓶后立即PBS洗涤2遍，这样会不会影响贴壁效果？还是要铺5min,0 X$ y& ]1 k3 e0 ?
以上方案，第二次剥脐带，有什么不妥，请各位指教。

chslyx

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) M* Q0 g  c  g; u6 H+ x" n2 {5 z  T/ k8 Z' q+ ]
请问一下是不是只去掉了动静脉就可以了？脐带表皮要去掉吗？

pcljsw2008

提提我的看法，第一，组织块太大了，而且密度太高，应该让组织块均匀分布在里面，互相不粘连，第二，楼主剥胶时间太长了，一般我操作只需要十五分钟，之后就是剪了，第三，组织块剪碎之后不用离心，要是脏的话离心一遍足够了，用生理盐水，不用用dpbs

yaoting111

接的太密了，让组织块均匀分布

weijunning

回复 湖南干细胞 的帖子0 y2 N% T8 T  V( I+ q6 A

: Y4 c3 N1 {9 U3 W) E污染了

weijunning

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) P4 y* {; @  E0 ~5 ]8 o$ L6 a6 G# a* _
你这样铺组织太密了，但是应该不会影响细胞爬出，大概在5天左右。下次组织块之间间隔大约0.5cm，留有空隙可以更有利于细胞爬出。

2013sp

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8 R  y2 m& g. n$ o
$ a; F+ W, Q1 v) i" o前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
: t5 _  W8 W2 e8 V& U1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
; v# J% A  u* X3 L2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。       
- z& c1 d0 U. O; O3 w' ^4 o$ L. ~3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
, Q; r- Z/ h. @3 i, I+ V/ y9 S' W" Q4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
3 x; K8 D0 p, Z' e5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。
8 o+ u: d2 f; `4 T- @6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。4 F9 ~3 V5 U; N( X. T; e* m/ G0 E+ J! W
7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。' Q. X& ]9 L1 ?6 Y& o
8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
( [% S' ^' P/ B. g9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
9 C0 Z1 R) n9 f" W2 |10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

2013sp

回复 单个核细胞 的帖子5 i3 v, g5 J! x; d# P
* G; U4 m% U1 M4 P- S& O+ e
前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。" u+ I& `) ?, T# {: d! q! @- r
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
9 `7 L3 ]  C! N# |2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。       
! s: M! |3 P* B! r% P3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
) Z3 c- y2 U4 r3 U: I# i- }4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。8 e. S+ u( b3 D( T6 G
5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。
' H: [) J$ T3 P2 b6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。
! f0 L" {4 E  U# w, W, X7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。
9 N+ d" ^$ L! |4 d+ [( W( y6 @" \( E5 l8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
% O' |( h: q: k  c) j% A9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。2 _& s9 q0 q/ U6 h( o' g9 x) p
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

2013sp

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5 J1 G' s! {# z- B
: u8 f" n2 K6 R前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
; ^% g* ^" E. {# ?" ^1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
# E, s; X& z' Z1 R; K& u2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。        $ ~3 w" T) b1 b" `7 g  Z
3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。( A& m" D" A( y; U( }8 X6 |
4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
" W. Z8 y2 M4 h  p5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。
! e: K- v  s' n5 \6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。
, x& M' j+ @# U5 g) u7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。6 p* u; n" ?% Y: |4 |! P$ @) _
8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
; x) A( C2 B/ f9 ~+ h  B9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。: B4 k+ [; H5 k8 A2 y
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

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前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。2 m9 T7 H! ]/ p2 m
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。1 n0 O' [' c. \( u
2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。        ; A- |2 U0 }$ Z# i
3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
6 o8 `6 U+ y0 y5 \8 t4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
9 F$ L. X1 D) }9 O, V5 r: d' J5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。
8 |) w! V9 V( ~  S6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。
; F4 M2 {% ?0 R7 o0 p2 w& ~% q$ a7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。
9 t" Z( q: a- `8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
. X9 j0 S8 e$ m1 L* b0 `9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。9 R9 |9 M$ ^  `( N! C, M* p
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。
6 d( J/ c( _% ?1 i. r: q11.        4~5天后进行全量换液，以后每三天按相同方法换液一次